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요약

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

모델 세포막은 초기 약물 발견에서 독성 연구에 이르기까지 응용 프로그램과 유용한 선별 도구입니다. 세포막은 세포 외 환경에서 내부 세포 구성 요소를 분리하는 모든 세포 유형에 대한 중요한 보호 장벽입니다. 이 막은 다양한 단백질 과 콜레스테롤과 더불어 외부 소수성 머리 단 및 내부 소수성 꼬리 단을 포함하는 지질 이중층의 주로 구성됩니다. 지질 자체의 조성 및 구조는 제약, 생물학적 독소 및 환경 독성물질을 포함할 수 있는 세포와 세포 미세 환경 간의 상호 작용을 포함하여 생물학적 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 연구에서는 지질 이중층을 모방한 단지질 및 다중 지질 지원 및 일시 중단 된 세포를 제조하는 방법이 설명되어 있습니다. 이전에는 지질 지질 인산화(PC) 지질 이중층뿐만 아니라 다중 지질 태반 열대 성 에서 영감을 얻은 지질 이중층이 분자 상호 작용을 이해하는 데 사용하기 위해 개발되었습니다. 여기서 두 가지 유형의 이중 레이어 모델을 달성하기 위한 방법이 표시됩니다. 다중 지질 양층을 모방하는 세포의 경우, 원하는 지질 조성물은 먼저 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LC-MS)에 선행된 1차 세포 또는 세포주로부터지질 추출을 통해 결정된다. 이 조성물을 사용하여, 지질 소포는 박막 수분 공급 및 압출 방법을 사용하여 제조되고 그들의 유체 역학 직경 및 제타 전위가 특징입니다. 지원되고 중단된 지질 양층은 각각 소멸 모니터링(QCM-D)을 이용한 석영 결정 마이크로밸런스를 이용하여 다공성 멤브레인에 형성될 수 있다. 대표적인 결과는 체외 세포막 지질 이중층 모델의 재현성과 다재다능함을 강조한다. 제시된 방법은 세포막을 가진 각종 분자 및 거대 분자의 투과, 흡착 및 embedment와 같은 상호 작용 기계장치의 신속하고 촉진적인 평가를 도울 수 있고, 약물 후보의 검열 및 잠재적인 세포 독성의 예측을 돕는.

서문

주로 인지질, 콜레스테롤 및 단백질로 구성된 세포막은 모든 살아있는 세포1의중요한 구성 요소입니다. 지질 양용성에 의해 구동되는 조직으로, 세포막은 보호 장벽으로 작동하고 세포가 주변 환경과 상호 작용하는 방법을조절2. 몇몇 세포 과정은 막1,2의지질 및 단백질 조성에 의존한다. 예를 들어, 세포막 상호 작용은 효과적인 약물 전달에 중요하다3. 제약, 생물학적 제제, 나노 물질, 생물학적 독소 및 환경 독성물질은 세포막의 무결성에 영향을 미치므로 세포 기능4에영향을 미칠 수 있다. 세포막의 지질 조성에 기초하여 멤브레인 모델을 모방하는 체외 세포 의 건설은 세포에 대한 이러한 물질의 잠재적 영향에 대한 연구를 크게 향상시키는 촉진 도구를 제공 할 가능성이 있다.

모델 지질 이중층은 지질 소포, 지원되는 지질 이중층 및 일시 중단된 지질 이중층을 포함한다. 지원되는 지질 이중층은 지질 소포가 지원되는 기판물질5,6,7,8,9에서파열되는 생명 공학 응용 분야에서 일반적으로 사용되는 인지질 세포막의 모델이다. 이중층 형성을 모니터링하는 데 사용되는 일반적인 기술 중 하나는 폐기 모니터링(QCM-D)을 사용하는 석영 결정 마이크로밸런스로, 이 경우, 시투8,10,11, 12,13,14의 벌크 액상 특성과 비교하여 소포의 흡착을 검사합니다. . 이전에는, QCM-D는 유동 조건하에서, 일단 포스파디들콜린 (PC) 지질 소포의 중요한 소포 커버리지가 표면에 달성되면, 그들은 자발적으로 강성 지질 이중층으로 파열한다는 것을 입증하기 위하여 이용되었습니다15. 이전 연구는 또한 다양한 지질조성물(16)을이용한 지원지질 이중층 형성, 지질 단백질17,18,19의편입, 폴리머쿠션(20)을활용하여 세포막 기능의 다양한 측면을 모방할 수 있는 지지지질 이중층을 산출하는 것을 조사하였다.

지질 이중층은 인지질, 콜레스테롤 및 글리콜리피드성분(21)을변경하여 미토콘드리온, 적혈구 및 간 세포막을 포함한 장기 수준으로 세포 에서 다양한 생물학적 장벽을 모방하는 데 사용되어 왔다. 이러한 더 복잡한 다중 지질 소포는 지질 조성물에 따라 소포 파열을 달성하기 위한 추가적인 방법이 필요할 수 있다. 예를 들어, 이전 연구는 C형 간염 바이러스의 비구조적 단백질(5A)으로부터 유래된 α-헬릭탈(AH) 펩티드를 활용하여 흡착지질소포(22,23)를불안정하게 함으로써 이중층 형성을 유도한다. 이 AH 펩티드를 이용하여, 태반 세포를 모방한 지지지질 이중층은 이전에형성되었다 24. 생체 의학 응용을 위한 지원지질 이중층의 큰 잠재력은 분자 및 나노입자 수송25,26,환경 독성 상호 작용 27, 단백질 조립 및 기능17,18,19,펩티드 배열 및 삽입28,29,약물 스크리닝 30 및 미세 유체 플랫폼31에걸친 조사와 함께 입증되었다.

일시 중단된 지질 이중층은 다공성 소수성인서트(32,33,34,35)에걸쳐 지질 이중층이 일시 중단되는 병렬 인공 막 투과성 분석(PAMPA)을 통해 약제학적 스크리닝 연구에 사용되어 왔다. PAMPA 지질 모델은 혈액-뇌, 부칼, 장 및 경피인터페이스(36)를포함한 다양한 생물학적 인터페이스를 위해 개발되었다. 지원되는 지질 이중층 과 PAMPA 기술을 결합함으로써, 원하는 조직 또는 세포 유형의 지질 성분 내에서 화합물의 흡착, 투과성 및 포함을 철저히 연구할 수 있다.

이 프로토콜은 여러 분자 상호 작용을 조사하기 위해 체외 세포막 지질 이중층 모델의 제조 및 적용을 설명합니다. 유니지질과 다중 지질 지원 및 일시 중단 된 지질 이중 레이어의 준비는 상세합니다. 지원되는 지질 이중층을 형성하기 위해, 지질 소포는 먼저 박막 수분화 및 압출 방법을 사용하여 개발되었으며, 그 다음에 물리화학적 특성화가 뒤따릅니다. PAMPA에서 사용하기 위해 중단된 지질 막의 QCM-D 모니터링 및 제조를 사용하여 지원되는 지질 이중층의 형성에 대해 논의된다. 마지막으로, 멤브레인을 모방하는 더 복잡한 세포 의 발달을 위한 다중 지질 소포를 검사합니다. 두 가지 유형의 제조 된 지질 막을 사용하여이 프로토콜은이 도구를 사용하여 분자 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. 전반적으로,이 기술은 높은 재현성과 다재 다능성을 가진 지질 이중층을 모방 세포를 생성합니다.

프로토콜

1. 유니 지질 소포 개발

  1. 박막 수분 공급 방법
    1. 지질 재고 솔루션의 준비 및 보관
      참고: 클로로폼을 사용하는 모든 단계는 화학 연기 후드에서 수행해야 합니다. 클로로폼은 항상 용매 안전 탄소 섬유 파이펫 팁을 사용하여 파이펫을 해야 합니다. 클로로폼을 함유한 솔루션은 항상 유리 바이알에 보관해야 합니다.
      1. 지질 분말을 함유한 유리병에 적절한 부피를 첨가하여 10 mg/mL 지질 육수 용액을 준비하고 잘 섞는다. 예를 들어, 20mL의 클로로폼을 L-α-인산염 콜린(계란, 닭고기)에 200 mg에 추가합니다. 재고 용액은 필요한 경우 다른 농도로 이루어질 수 있습니다.
        참고: 분말 지질이 앰플에 저장된 경우, 폴리테트라플루오로티렌(PTFE) 라이닝 캡을 사용하여 유리 바이알에 클로로폼 이송을 첨가한 후.
      2. 파라필름으로 바이알 캡을 밀봉하고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
    2. 드라이 지질 필름 의 형성
      1. 2.5 mg/mL의 최종 소포 농도에 필요한 깨끗한 유리 바이알에 지질 스톡 용액의 적절한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어, 2.5 mg/mL에서 계란 PC 소포 1mL을 형성하기 위해, 피펫 250 μL의 달걀 PC 스톡 용액을 바이알로 한다.
        참고: 준비된 볼륨은 사용 중인 압출기 프로세스에 따라 달라질 수 있습니다(1.3단계 참조). 미니 압출기 최대 권장 볼륨은 1mL이며 대형 압출기 볼륨 범위는 5-50mL입니다.
      2. N2 가스(초순수 5.0 등급)의 스트림을 사용하여 지질 스톡 용액에서 클로로포름을 제거합니다.
      3. 클로로폼을 완전히 제거하려면 말린 지질 필름을 진공 청소기에 연결하고 적어도 4 시간 동안 둡니다.
        참고: 여기서 프로세스를 중지할 수 있습니다. 지질 필름이 진공 건조 직후에 사용되지 않는 경우, 사용될 때까지 건조기에 보관하십시오. 우리는 이 지질 필름이 이 조건에서 저장의 1 주 후에 유사한 질 소포를 산출한다는 것을 관찰했습니다; 필요한 경우 더 긴 저장 기간을 따르는 소포 품질을 더 자세히 살펴봐야 합니다.
    3. 동결 해동 소용돌이 주기 수행
      1. 트리스 염화물(NaCl) 버퍼 용액은 트리스 베이스 10mM, NaCl 100mMM을 함유하고 있습니다. 건조지질막을 트리스 NaCl 버퍼의 필요한 부피로 재수화하여 약 15-30초 동안 2.5 mg/mL 및 소용돌이의 최종 소포 농도를 산출한다.
      2. 소포 현탁액을 냉동될 때까지 약 30분 동안 드라이 아이스가 있는 용기에 옮기십시오. 시료가 완전히 동결된 후 30-40°C 수조에서 서스펜션을 해동하십시오. 해동 된 소포 서스펜션을 소용돌이.
        참고: 액체 N2드라이 아이스 대신 사용할 수 있습니다. 소포 현탁액을 액체 질소로 30s로 옮은 다음 80°C 수조에서 즉시 해동합니다.
      3. 반복 단계 1.1.3.2 추가 4 번, 총 5 동결 해동 소용돌이 주기에 대 한.
  2. 압출 성형
    참고: 동결-해동 소용돌이 주기가 완료되면 다발성 소포가 형성됩니다. 압출은 크기를 줄이고 큰 유니라멜라 소포를 개발하는 데 도움이 됩니다.
    1. 미니(1mL) 압출기 공정
      1. 초순수수의 온화한 세제를 사용하여 압출기의 모든 성분을 철저히 청소하고 모든 세제를 제거할 수 있도록 초순수물로 적어도 3회 이상 헹구십시오. N2 가스로 건조하십시오.
      2. 두 개의 내부 멤브레인 지지체와 O-링(내경 12.7mm, 외경 15.2 mm)을 조립합니다. O 링이 향하고 있도록 각 멤브레인 지지체를 배치합니다.
      3. 초순수로 필터 지지대를 미리 적시합니다. O 링 내부에 멤브레인 지지면에 놓습니다. 두 번째 내부 멤브레인 지원에 대해 반복합니다.
      4. 하나의 내부 멤브레인 지지체를 압출기 외부 케이스에 배치합니다. 100nm 폴리카보네이트 멤브레인 1개를 내부 멤브레인 지지에 직접 배치합니다.
        참고: 폴리카보네이트 멤브레인은 파란색 종이 조각 사이에 별도로 저장됩니다. 멤브레인 지지에 삽입하기 전에 분리 용지를 제거합니다.
      5. 폴리카보네이트 멤브레인을 향한 O-링 및 필터 지지측을 통해 제2 내부 멤브레인 지지체를 압출기 외부 케이스에 배치합니다. PTFE 베어링을 리테이너 너트에 부착하고 압출기 외부 케이스로 닫혀 나사를 닫습니다. 압출기를 가열 블록에 잘라냅니다.
      6. 지질 소포 현탁액을 주사기 중 하나에 적재하고 주사기를 압출기 열 블록에 배치하여 바늘을 압출기의 한쪽 끝에 완전히 삽입합니다. 두 번째 빈 주사기를 반대쪽에 삽입하고 열 블록의 팔 클립을 사용하여 두 주사기에 고정합니다.
        참고: 필요한 경우 압출기 열 블록을 핫 플레이트에 놓고 온도를 지질의 전이 온도보다 높은 값으로 설정합니다. 온도계를 열 블록에 내장된 홀더에 삽입하여 정확한 온도 측정값을 만들고 필요한 온도에 도달할 때까지 기다립니다(~15분). 계란 PC 지질 소포는 압출 동안 열을 필요로하지 않습니다.
      7. 소포 현탁액을 빈 주사기에 천천히 밀어 넣은 다음 원래 주사기로 다시 넣습니다. 누출을 나타내는 압출 전체의 압력 변경을 모니터링합니다. 폴리카보네이트 멤브레인을 통과하는 총 21회 동안 20회 더 반복합니다. 지질 소포를 깨끗한 유리 유리 바이알로 옮겨 보관하십시오.
        참고: 지질 조성물에 따라 압출 수를 최적화할 수 있습니다.
      8. 열을 사용하는 경우 압출 된 소포 현탁액이 실온에 도달하도록 하십시오. 압출 된 지질 소포를 추가 사용까지 4 °C에 보관하십시오.
        참고: 권장된 소포 저장 지속 시간은 지질 조성에 크게 의존하며, 소포 물리화학적 특성(예: 유체역학 직경, 제타 전위)은 시간이 지남에 따라 모니터링되어야 합니다. 예를 들어, 계란 PC 소포는 소포 크기 또는 이중 층 형성 용량의 변화없이 적어도 2 주 동안 저장되었습니다.
    2. 대형(5~50mL) 압출기 공정
      참고: 선택한 지질에 열이 필요한 경우 1.2.2.1-1.2.2.5 단계를 따르십시오. 열이 필요하지 않은 경우 1.2.2.5 단계로 건너뜁니다. 단계 1.2.2.1-1.2.2.4 계란 PC에 대 한 필요 하지 않습니다.
      1. 역삼투(RO) 물로 1L 플라스크를 채웁니다.
        참고: 압출기 실린더에서 금속 이온이 침출될 수 있으므로 초순수수를 사용하여 50mL 시스템을 순환시키지 마십시오.
      2. 뜨거운 접시에 물 욕조에 1 L 플라스크를 놓고 지질의 전이 온도 위의 온도에 뜨거운 접시를 설정합니다.
      3. 샘플 실린더의 입구를 통해 유연한 튜브를 플라스크에 부착합니다. 실린더 의 콘센트에 튜브를 1 L 플라스크의 상단에 부착합니다. 필요에 따라 입구와 콘센트 모두에서 튜브를 안전하게 보관하십시오. 이렇게 하면 샘플 실린더를 통해 물의 단방향 흐름이 생성됩니다.
      4. 펌프를 켜서 물 순환을 시작합니다. 열이 필요한 경우 시료 실린더가 원하는 온도에 도달할 수 있도록 약 30-45분 간 허용하십시오.
      5. 압력 릴리프 밸브 장치에 부착된 유연한 커넥터를 통해 샘플 실린더의 캡을 질소 탱크에 연결합니다.
      6. 50mL 압출기의 모든 부분을 70%(v/v) 에탄올로 청소합니다.
      7. 압출기는 큰 구멍 화면 지지대, 소결 디스크, 드레인 디스크 및 폴리 카보네이트 멤브레인을 압출기 하부 지지체의 공간에 배치하여 압출기를 조립합니다. 4개의 나사를 사용하여 압출기 상부 및 하부 지지대를 연결하고 조입니다.
      8. 압출기 유닛을 바닥으로 나사로 조이고 렌치로 조여 서 시료 실린더에 부착하여 고정합니다.
        참고: 열을 사용하는 경우 온도계를 실린더에 넣고 물이 원하는 온도에 도달할 때까지 기다렸다가 계속합니다. 이렇게 하면 전체 압출 공정에서 샘플 온도가 유지됩니다.
      9. 샘플 실린더를 초순수물로 채웁니다. 샘플 실린더에 샘플을 추가하기 전에 압출기 장치를 통해 물을 돌출합니다. 이것은 미니 압출기와 유사한 멤브레인을 미리 습식하기 위해 수행됩니다.
        참고: 캡이 완전히 나사로 묶여 있고 질소를 켜기 전에 압력 릴리프 밸브가 완전히 닫혀 있는지 확인합니다. 이 단계(~5-10 psi)에는 최소한의 압력이 필요합니다.
      10. 지질 소포 서스펜션을 샘플 실린더에 넣고 상단을 닫은 나사로 닫습니다. 샘플이 압출기 장치에서 약 2-3 방울 /s의 속도로 깨끗한 유리 유리 바이알로 떨어지기 시작할 때까지 천천히 압력을 증가시다.
        참고: 너무 많은 압력이 막에 부정적인 영향을 미치고 압출실패로 이어질 수 있기 때문에 이 단계에서 압력을 빠르게 증가시키지 마십시오.
      11. 모든 샘플이 압출되면N2 공급을 끄고 압력 릴리프 밸브를 천천히 열어 샘플 실린더의 압력을 방출합니다. 지질 소포를 시료 실린더에 다시 붓고 총 10개의 압출을 위해 1.2.2.11 단계를 반복합니다.
        참고: 샘플이 폴리카보네이트 멤브레인 모공 크기에 더 균일하고 가깝기 때문에 압출에 필요한 압력이 증가할수록 압출 수가 증가할 수 있습니다.
      12. 압출 된 지질 소포 서스펜션을 4 °C에서 추가 사용까지 보관하십시오.

2. 지질 소포 의 특징

  1. 동적 광 산란(DLS)을 이용한 유체역학 직경 측정
    1. 지질 소포 및 피펫 50 μL의 지질 소포 서스펜션은 일회용 저용량 큐벳으로 들어갑니다. 먼지와 이물질로 오염을 방지하기 위해 덮개를 덮습니다.
    2. 소포 서스펜션을 DLS 기기에 로드하고, 샘플 세부 정보를 입력하고, 관련 소프트웨어를 사용하여 측정을 수행합니다.
  2. 제타 잠재력
    1. 초순수, 70% 에탄올, 초순수로 세척하여 접힌 모세관 제타 세포를 셀의 입력에 연결하는 주사기를 사용하여 준비합니다. 액체를 셀을 3-4번 부드럽게 밀어 내고 다음 용액으로 전환하기 전에 셀을 완전히 비웁습니다.
    2. 지질 소포를 소용돌이치고 초순수수에서 지질 소포를 1:10(v/v) 희석시 준비합니다.
    3. 희석된 지질 소포 현탁액을 적재합니다. 주사기 사이현탁액을 앞뒤로 밀어기 포기포를 제거합니다. 스토퍼를 각 입구에 부착합니다.
      참고: 측정에 영향을 미치기 때문에 모든 기포를 제거하는 것이 중요합니다.
    4. 제타 셀을 샘플 챔버에 배치하여 전극이 접촉하도록 합니다. 샘플 챔버 상단을 닫습니다. 관련 소프트웨어에서 샘플 세부 정보를 입력하고 측정을 수집합니다.

3. QCM-D를 사용하여 유니 지질 지원 지질 이중 층 형성

  1. 솔루션 준비
    1. 초순수수에서 도데딜 황산나트륨(SDS) 용액을 2% (w/v) 준비한다. 완전히 녹을 때까지 저어접시에 섞으세요. 최소 10mL의 초순수, 2% SDS 및 Tris NaCl의 Aliquot 작업 솔루션.
    2. 트리스 NaCl 버퍼에서 지질 소포희석을 준비한다. 소포의 농도는 응용 프로그램에 따라 달라집니다. 계란 PC의 경우, 0.01-0.5 mg/mL 범위의 농도는 성공적인 지원 지질 이중층 형성을 초래하는 것으로 나타났습니다.
  2. 실리카 코팅 석영 크리스탈 센서 청소
    참고: QCM-D 결정 세척은 사용되는 센서의 표면 재질에 따라 달라집니다. 지원되는 지질 이중층을 형성하기 위해 실리카 코팅 석영 결정은 이 프로토콜에 사용되며 제조업체의 표준 작동 절차에서 적용된 대로 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
    1. 실리카 코팅 석영 결정 센서를 유량 모듈에 삽입하여 결정의 "t"가 모듈의 "t"와 정렬되도록 합니다. 흐름 모듈이 닫혔습니다.
      참고: 활용된 QCM-D가 여러 흐름 모듈을 동시에 연결하고 실행할 수 있도록 허용하는 경우 필요에 따라 추가 모듈에 대한 다음 절차를 반복합니다.
    2. 분석기 시스템과 연결하는 유동 모듈의 전극을 사용하여 계측기 의 베이스에 유동 모듈을 삽입합니다. 모듈을 제자리에 잠급니다.
    3. 유입구와 콘센트 튜브를 유량 모듈 및 펌프에 연결합니다. 튜브를 홀딩 가드에 넣고 분석기 시스템의 뚜껑을 닫습니다. 펌프 의 콘센트에 폐기물 용기를 배치하여 사용 된 솔루션을 수집합니다.
    4. 청소를 수행하려면 먼저 펌프를 켭니다. 유동 속도를 400 μL/분으로 설정합니다. 유입구튜브를 초순수물에 삽입하고 모듈을 통해 5-10mL를 흐르십시오.
    5. 입구 튜브를 2% SDS로 전환하고 모듈을 통해 5-10mL를 흐르십시오. 입구 튜브를 다시 초순수로 전환하고 모듈을 통해 10-20mL를 흐르십시오. 용액에서 입구 튜브를 제거하고 모든 액체가 배출 될 때까지 튜브를 통해 공기를 흐르십시오.
      참고: 위의 청소 프로토콜은 모든 측정 전후에 매일 사용됩니다. 필요에 따라 철저한 청소를 수행할 수 있습니다. 간략하게, 철저한 청소를 수행하려면, 흐름 모듈을 분해. 유동 모듈의 전극 측면을 제외한 모든 구성 요소는 2 % (w /v) SDS 및 목욕 초음파 처리된 다음 초순수 물로 철저히 헹구고N2 가스 스트림으로 건조해야합니다. 전극 핀을 포함하는 유동 모듈의 구성 요소는 액체와 접촉해서는 안됩니다.
    6. 유량 모듈에서 센서를 제거하고 초순수물로 센서를 헹구는 다. N2 가스 스트림으로 센서를 건조시다. N2 가스 스트림으로 유량 모듈을 건조시다. 전극이 항상 액체가 없는 상태로 유지되도록 하십시오.
    7. 화학 연기 후드에 실리카 코팅 석영 크리스탈 센서를 자외선(UV)/오존 세정제 기구에 삽입합니다. 기기를 켜고 2 분 이상 치료를 허용하십시오. 센서를 조심스럽게 제거하고 유량 모듈로 돌아갑니다.
  3. 트리스 NaCl 기준선 형성
    1. 분석기 계측기를 켜서 관련 소프트웨어에 연결하고 지원되는 지질 이중레이어에 대해 원하는 값으로 온도를 설정합니다. 온도가 원하는 입력으로 안정화되도록 합니다.
      참고: 설정된 온도가 실온 보다 높은 경우 모든 솔루션은 열 블록을 사용하여 동일한 온도로 가열되어야 합니다.
    2. 측정을 시작하기 전에 측정을 구성하고 모든 센서 공명 주파수 및 배음 3, 5, 7, 9, 11 및 13에 대한 소멸을 찾습니다.
      참고: 이 고조파가 지나치게 민감하고 시끄러운 데이터를 생성하기 때문에 1st 배음은 무시될 수 있습니다.
    3. 펌프를 켜고 유량을 175 μL/min 또는 원하는 실험 유량으로 설정합니다.
    4. Tris NaCl에 삽입하기 전에 에탄올로 입구 튜브를 닦아냅니다. 측정을 시작하고 트리스 NaCl을 흐르기 시작합니다.
      참고: 데이터는 실시간으로 수집되고 모니터링됩니다. 유량 모듈의 공기에서 액체로의 변화는 급속한 방출변화(ΔD)증가 및 주파수변화(ΔF)감소에 의해 데이터 수집 소프트웨어에서 관찰될 것이다.
    5. Tris NaCl이 5-10분 동안 모듈을 통해 흐르도록 하여 액체의 기준선 ΔF 및 ΔD 값이 안정적으로 유지되도록 합니다.
  4. 유니지질 지원 지질 이중레이어 형성
    1. 펌프를 멈추고 Tris NaCl 솔루션에서 입구 튜브를 제거하고 지질 소포 용액에 조심스럽게 삽입하십시오. 5s의 백 플로우가 유입튜브에서 기포를 제거한 다음 앞으로 계속 됩니다. 소프트웨어의 측정을 다시 시작하여 기준선을 0으로 설정합니다.
      참고: 모듈을 통해 흐르고 이중 레이어 형성 및 데이터 기록을 방해할 수 있는 튜브의 기포를 피하십시오.
    2. 이중층 형성이 데이터 수집 소프트웨어에서 실시간으로 관찰될 때까지 지질 소포를 플로우합니다(계란 PC 소포의 경우 최소 8분).
    3. 3.4.1단계를 반복하여 지질 소포에서 인렛 튜브를 트리스 NaCl 버퍼로 다시 변경합니다.
      참고: 원하는 적용이 분자 상호 작용을 연구하는 경우 솔루션 흐름이나 데이터 수집을 중지하지 않고 6.1 단계로 직접 계속하십시오. 이중레이어 형성이 끝점인 경우 3.4.4단계로 진행합니다.
    4. 소프트웨어에서 측정을 중지하고 파일을 저장합니다. 펌프를 중지합니다.
    5. 프로토콜 단계 3.2.4 및 3.2.5에 따라 유량 모듈 및 실리카 코팅 석영 결정 센서를 청소하십시오.

4. 중단된 지질 이중레이어 형성

참고: 일시 중단된 지질 이중층을 형성하기 위한 프로토콜은 필터 플레이트제조업체(37)가제공하는 병렬 인공 막 투과성 분석(PAMPA) 프로토콜으로부터 적응된다.

  1. 20 mg/mL에서 도데칸에서 원하는 지질을 용해시키는 (예를 들어, 1,2-dioleoyl- sn-글리세로-3-인포콜린 (DOPC)).
  2. 다공성 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 96웰 멀티스크린 필터 플레이트(0.45 μm 모공 크기)인 기증자 구획에 지질 용액의 5μL을 추가합니다.
  3. 즉시 1× 인산완충식식(PBS)의 300μL을 포함하는 수송 수신기 플레이트인 감차 컴파트먼트에 필터 플레이트를 즉시 침수한다. 기증자 구획에 1× PBS의 200 μL을 추가합니다.
    참고: 지질만 필터와 1× PBS에 노출된 처리되지 않은 필터의 컨트롤이 포함될 수 있습니다.
  4. 일시 중단 된 지질 이중 층과의 분자 상호 작용을 조사하기 위해 섹션 6.2로 직접 계속하십시오. 중단된 이중층을 형성하는 16시간 이내에 연구를 완료하는 것이 좋습니다.

5. 소포와 이중층을 모방한 다중 지질 세포 개발

  1. 포유류 세포에서 지질 추출
    참고 : 지질 추출은 Bligh-Dyer 접근방식 38을따릅니다.
    1. 원하는 세포줄을 적절히 배양합니다. 70-80% 합류(T75 플라스크)를 달성한 후, 트립신-에틸렌디아민트레타아세산(37°C)을 5분 동안 사용한 분리세포를 사용한다.
    2. 200 × g에서 원심분리기 세포는 5분 동안. 초순수 1mL에서 초신수를 제거하고 세포 펠릿을 다시 분리한다.
    3. 1:2 (v/v) 클로로폼의 혼합물인 3.75mL를 셀 서스펜션및 소용돌이에 15분 간 첨가한다. 그런 다음 1 분 동안 클로로폼과 소용돌이 1.25 mL을 추가하십시오. 마지막으로 1.25mL의 물과 소용돌이를 1분 동안 추가합니다.
    4. 원심 분리기 세포 혼합물은 10 분 동안 1000 x g에서 혼합물을 혼합합니다. 유기 상에 지질을 포함하는 액체의 바닥 층을 수집합니다. N2 가스의 스트림에서 건조.
    5. C18 역상, 3.5 μm × 50mm 컬럼을 사용하여 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 지질 함량을 정량화한다.
    6. 모바일 단계의 경우, 60:40 (v/v) 아세토닐레:물과 90:10 (v/v) 이소프로파놀:아세토닐릴로 두 가지 솔루션을 준비합니다. 암모늄 용매는 10 mM의 최종 농도에서 두 솔루션모두에 추가되어야합니다. 60분 이상 이동상 그라데이션을 두 번째 솔루션의 35%(v/v)에서 95%(v/v)로 늘립니다.
    7. 연속적인 전체 스캔 MS 및 탠덤 MS/MS. 질량 대 충전(m/z) 비율에서 개별 인지질 종을 식별하여 음의 이온화 모드에서 유출물을 감지합니다. LIPID MAPS 질량 분광 분석 도구를 사용하여 충돌 유발 해리 조각화에서 질량 스펙트럼을 분석합니다. 추출된 이온 크로마토그램을 얻어 곡선 아래 영역을 통합하여 각 지질 종의 풍부를 결정합니다.
    8. 주요 지질 클래스를 포함하는 지질 표준에 대해 단계 5.1.5-5.1.7을 수행하여 각 상이한 인지질 클래스에 대한 검출의 상대적 민감도를 결정한다.
  2. 다중 지질 소포 개발
    1. 1.1.1 단계에서 5.1 단계에서 확인된 대로 원하는 각 이중층 성분을 나타내는 지질 용 육수 솔루션을 준비하십시오.
    2. 5.1 단계에서 얻은 지질 조성물에 기초하여, 2.5 mg/mL의 최종 소포 농도에 필요한 깨끗한 유리 바이알에 지질/클로로폼 스톡의 적절한 부피를 추가한다. N2 가스 스트림에서 대량 클로로포형 건조 용액을 제거합니다.
    3. 1.1.2, 1.1.3 및 1.2 단계를 수행하여 다중 지질 소포를 형성합니다. 소포 특성화에 대한 2 단계를 따르십시오.
  3. QCM-D를 사용하여 다중 지질 지원 지질 이중레이어 형성
    참고: 일부 다중 지질 소포는 3단계에서 제시된 유니지질 PC 소포와 유사한 자발적인 지질 소포 파열 및 이중층 형성을 초래할 수 있습니다. 그러나, 더 복잡한 다중 지질 소포는 소포 파열을 돕기 위하여 외부 입력을 요구할 수 있습니다. 여기서, AH 펩티드는 소포의 외부 전단지를 불안정하게 하여 이중층 형성을 초래한다. 불안정화 및 소포 파열을 달성하는 다른 방법은 원하는 경우 고려될 수 있다.
    1. 3단계를 따라 5.2단계에서 형성된 다중 지질 소포를 활용한 다중 지질 지원 지질 이중층을 형성한다.
    2. 이중층으로 소포의 자발적인 파열이 관찰되지 않으면 AH 펩티드를 사용하여 소포 불안정을 시도하십시오. AH 펩티드 (펩티드 시퀀스: H-Ser−Gly−Trp−Leu−Arg−Asp−Val−Trp−Asp−Trp−Trp−Ile-Cys−Thr−Val−Thr−Asp−Asp−Lys-Thr-Trp-Leu-−Gln−Ser-Lys−Leu−Asp−Tyr-Lys−Asp-NH2)솔루션 1% (v/v) 디메틸술프리산화물, DMSO.
    3. 3.4.1-3.4.3 단계를 따르십시오. 3.4.3 단계 후, INLET 튜브를 AH 펩티드 용액으로 변경합니다. ΔF 및 ΔD가 새로운 솔루션 추가에서 관찰될 때까지 유량 모듈에 솔루션을 도입합니다. 펌프를 멈추고 AH 펩타이드가 소포로 10분 동안 배양할 수 있도록 하십시오.
    4. 인렛 튜브를 Tris NaCl으로 전환하고 파열된 소포에서 AH 펩티드를 제거하여 지질 이중층의 성공적인 형성을 이끕니다.
      참고: 원하는 적용이 분자 상호 작용을 연구하는 경우 솔루션 흐름 이나 데이터 수집을 중지하지 않고 6.1 단계로 방향을 계속합니다.
    5. 소프트웨어에서 측정을 중지하고 파일을 저장합니다. 펌프를 중지합니다.
    6. 프로토콜 단계 3.2.4-3.2.6에 따라 유량 모듈 및 실리카 코팅 석영 결정 센서를 청소하십시오.
  4. 일시 중단 된 멀티 지질 이중 층
    1. 20 mg/mL에서 도데칸에서 원하는 지질의 혼합물을 용해시합니다.
    2. 원하는 세포 모방 조성물을 사용하여 5 μL 지질 혼합 용액을 구성합니다.
    3. 4.2 및 4.3 단계를 따르십시오.
      참고: 일시 중단된 지질 이중층과의 분자 상호 작용을 조사하기 위해 6.2 단계로 직접 계속하십시오.

6. 유니 지질 및 다중 지질 양층과의 분자 상호 작용 연구

  1. QCM-D를 사용하여 지원되는 지질 이중층과의 분자 상호 작용 연구
    1. 지원되는 지질 이중층으로 흡착을 조사하기 위해 원하는 분자의 용액을 준비한다. 예를 들어, 트리스 나클에서 200 μM di(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)의 용액을 1%(v/v) DMSO로 준비한다.
    2. 분자 용액이 Tris NaCl에서 제조되는 경우, 다중 지질 이중층에 대한 3.4.3 단계 또는 5.3.4 단계 다음에 직접 흐를 수 있다. 분자가 다른 용매에서 제조되어야 하는 경우, 대신 적어도 5 분 동안 혼자 원하는 용매에 입구 튜브를 삽입 (예를 들어, Tris NaCl 1% (v/v) DEHP에 대한 DMSO).
      참고: 용매로 인한 점도 변화는 관심 있는 분자의 도입 전후에 이를 흐르고 이를 모니터링및 고려할 수 있다.
    3. 관심 분자를 포함하는 용액으로 유입 구빙을 5분 이상 전환합니다. 상기 흐름은 또한 원하는 분자를 함유하는 액체가 원하는 경우 바이레이어로 배양할 수 있도록 허용될 수 있다.
    4. 트리스 NaCl 이외의 무언가가 있는 경우 분자 용매로 다시 튜브를 변경합니다. 5분 이상 흐르고 있습니다. 그런 다음 인렛 튜브를 Tris NaCl으로 전환하고 최소 5 분 동안 흐십시오.
    5. 소프트웨어에서 측정을 중지하고 파일을 저장합니다. 펌프를 중지합니다.
    6. 프로토콜 단계 3.2.4-3.2.6에 따라 유량 모듈 및 실리카 코팅 석영 결정 센서를 청소하십시오.
  2. PAMPA를 사용하여 중단된 지질 이중층과의 분자 상호 작용 연구
    1. 원하는 분자의 용액을 준비한다. 예를 들어 1% (v/v) DMSO로 1× PBS로 200 μM DEHP를 준비합니다.
    2. 웰 당 신선한 1x PBS의 300 μL새로운 전송 수신기 플레이트를 준비합니다.
    3. 다중 지질 부유 물레이어에 대한 단지질 정지 이중레이어 또는 4.4.3에 대한 단계 3.3 직후, 다중 화면 필터 플레이트의 기증자 구획에서 1× PBS를 제거하고 시험 용액의 200 μL로 교체한다. 6.2.2 단계에서 준비된 수송 수신기 플레이트에 즉시 침수.
    4. 25°C에서 원하는 시간(예: 2h)에 부드러운 흔들림으로 배양합니다.
    5. 인큐베이션 후, 기증자 및 수용자 구획으로부터 용액의 150 μL을 수집합니다. 이 분자의 특성에 따라 적절한 방법을 사용하여 두 샘플모두에서 분자 농도를 측정합니다.
      1. 예를 들어, DEHP용 280 nm과 같은 적절한 흡광도 파장을 가진 마이크로 플레이트 분광광계를 사용하고 관심 분자의 표준 곡선과 비교한다.
    6. 다음 방정식을 사용하여 관심 분자의 명백한 투과성(P앱)을계산합니다.
      figure-protocol-13504 (1)
      어디에 figure-protocol-13582 (2)
      참고: [시험 화합물]수용자는 관심 분자의 농도(예를 들어, DEHP)를 시간에, t, 수용자 구획에서; 및 [시험 화합물]초기 분자의 초기 농도이다. A는 멤브레인 영역, t는 시간이며, VD는 기증자 구획 부피이며, VA는 수용자 구획 부피이다.

결과

이 프로토콜은 지지및 일시 중단된 지질 이중층을 형성하는 방법을 자세히 설명한다(도1). 지원되는 지질 이중층을 형성하는 첫 번째 단계는 지질 소포를 개발하는 것입니다. 미니 압출기는 소량의 지질 소포(1mL 이하)를 준비할 수 있게 해주며, 대형 압출기는 5-50mL의 지질 소포를 한 배치로 준비할 수 있게 합니다. 미니 또는 대형 압출기에 의해 형성된 유니지질 소포의 크기 ...

토론

이 프로토콜은 지질 소포의 형성을 허용, 지원 지질 이중 층, 및 일시 중단 지질 이중 층. 여기서는 이러한 각 구조를 형성하기 위한 중요한 단계가 제공됩니다. 지질 소포를 형성할 때,지질(39)의전이 온도 이상으로 돌출하는 것이 중요하다. 전이 온도 이하의 경우, 지질은 주문된 젤 상39에물리적으로 존재한다. 이 주문된 단계에서 탄화수소 지질 꼬리는 완전히 ...

공개

저자는 이해 상충이나 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 자료는 그랜트 제1942418 하여 국립과학재단이 지원하는 작품과 1644760 C.M.B.H.에 수여된 국립과학재단 대학원 연구 펠로우십을 기반으로 합니다. 이 자료에 표현된 의견, 사실 인정 및 결론 또는 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다. 저자는 지질 소포 특성화 데이터 수집에 대한 박사 노엘 베라 - 곤잘레스 에게 감사드립니다. 저자는 그의 제타저 사용에 대한 교수 로버트 허트 (브라운 대학)에게 감사드립니다. 저자는 브라운 대학 질량 분광 시설, 특히, 박사 툰 리 셴 지질 구성정량에 대한 도움을 주셔서 감사합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC)Avanti Polar Lipids850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)Avanti Polar Lipids840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)Avanti Polar Lipids850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)Avanti Polar Lipids840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE)Avanti Polar Lipids850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))Avanti Polar Lipids890703
3 mL Luer-Loc syringesBD309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber linerDuran Wheaton KimbleW224605
AcetonitrileSigma-Aldrich271004
AlconoxFisher Scientific50-821-781
Ammonium formateMillipore SigmaLSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFireWaters 186002551
ChloroformMillipore SigmaLSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPKSarstedt67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)Millipore Sigma36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore SigmaLSAC472301
EthanolPharmco111000200
Filter supports, 10 mmAvanti Polar Lipids610014Size for mini extruder
Folded capillary zeta cellMalvern PanalyticalDTS1070
IsopropanolSigma-Aldrich190764-4L
KimwipesKimberly Clark34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)Avanti Polar Lipids840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids840051
LiposoFast ® LF-50Avestin, Inc.
MethanolSigma-Aldrich179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating blockAvanti Polar Lipids610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterileMillipore SigmaMAIPS4510for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapureTechAirNI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 umWhatman800309Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 umWhatman110605Size for large extruder
ParafilmBemisPM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10xGenesee Scienfitic25-507XDilute to 1x
Qsoft 401 softwareBiolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense AnalyzerBiolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mLDuran Wheaton Kimble986561
Silicon Dioxide, thin QSensorsBiolin ScientificQSX 303
Sodium chloride (NaCl)Millipore SigmaLSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Fisher ScientificBP166-100
Solvent Safe pipette tipsSigma-AldrichS8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids860061
Trizma baseMillipore SigmaLSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acidCaisson LabsTRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mmWhatman230600Size for large extruder
Zetasizer ZS90Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 softwareMalvern Panalytical

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