JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。

要約

モデル細胞膜は、創薬初期から毒性研究に至るまでの用途を備えた有用なスクリーニングツールです。細胞膜は、細胞外環境から細胞内成分を分離し、すべての細胞タイプのための重要な保護障壁です。これらの膜は、様々なタンパク質およびコレステロールと共に、外側の親水性ヘッド基および内側の疎水性尾基を含む脂質二重層から構成される大部分を占める。脂質の組成と構造は、細胞と細胞微小環境との相互作用を含む生物学的機能を調節する上で重要な役割を果たします。本研究では、脂質二重層を模倣するユニ脂質およびマルチ脂質を支持し、懸濁細胞を処方する方法について説明する。以前は、分子相互作用を理解するために、ユニ脂質ホスファチジルコリン(PC)脂質二重層ならびに多脂質胎盤性栄養芽細胞に触発された脂質二重層が開発されました。ここでは、両層モデルの両方を達成するための方法を提示する。細胞模倣多重層の場合、所望の脂質組成物は、まず、一次細胞または細胞株からの脂質抽出を介して決定され、続いて液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)が続く。この組成物を用いて、脂質小胞は薄膜水和および押出方法を用いて作製され、それらの流体力学的直径およびゼータ電位が特徴付けられる。サポートされ、懸濁された脂質二重層は、次に、散逸モニタリング(QCM-D)と並列人工膜透過性アッセイ(PAMPA)で使用するための多孔質膜上の水晶マイクロバランスを使用して形成することができる。代表結果は 、体外 細胞膜脂質二重層モデルの再現性と汎用性を強調しています。提示された方法は、細胞膜を有する様々な分子および高分子の浸透、吸着、埋め込みなどの相互作用メカニズムの迅速かつ容易な評価を助け、薬物候補のスクリーニングおよび潜在的な細胞毒性の予測に役立つ。

概要

細胞膜は、主にリン脂質、コレステロール、およびタンパク質から構成され、全ての生細胞1の重要な構成要素である。脂質両親媒性によって駆動される組織では、細胞膜は保護障壁として機能し、細胞がその周囲の環境とどのように相互作用するかを調節する2。いくつかの細胞プロセスは、膜1、2の脂質およびタンパク質組成に依存する。例えば、細胞膜相互作用は、効果的な薬物送達3にとって重要である。医薬品、生物学的製剤、ナノ材料、生物学的毒素、および環境毒性物質は、細胞膜の完全性に影響を与え、細胞機能4に影響を及ぼす可能性がある。細胞膜の脂質組成に基づくインビトロ細胞模倣膜モデルの構築は、細胞に対するこれらの材料の潜在的な影響の研究を大幅に強化するファシリティツールを提供する可能性を秘めています。

モデル脂質二重層は、脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を含む。サポートされる脂質二重層は、サポートされる基板材料5、6、7、8、9で脂質小胞が破裂するバイオテクノロジー用途で一般的に使用されるリン脂質細胞膜のモデルである。二重層形成を監視するために使用される一般的な技術の1つは、水晶結晶マイクロバランスと散逸モニタリング(QCM-D)であり、それは、その場8、10、11、12、13、14のバルク液体特性と比較して小胞の吸着を調べる.以前、QCM-Dは、フロー条件下で、一度ホスファチジルコリン(PC)脂質小胞の臨界小胞被覆が表面上で達成されることを実証するために使用されてきたが、それらは、硬質脂質二重層15に自発的に破裂する。また、脂質組成16の様々な脂質を用いた支持脂質二重層形成、脂質タンパク質17、18、19の組込み、およびポリマークッション20を利用して、細胞膜機能の様々な局面を模倣し得る支持脂質二重層を得たことも調べてきた。

脂質二重層は、リン脂質、コレステロール、および糖脂質成分21を改変することにより、ミトコンドリア、赤血球、および肝臓細胞膜を含む細胞下から器官レベルまで様々な生物学的障壁を模倣するために使用されてきた。これらのより複雑な多脂質小胞は、脂質組成に応じて、小胞破裂を達成するための追加の方法を必要とするかもしれない。例えば、以前の研究では、C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質5Aに由来するαヘリカル(AH)ペプチドを利用して、吸着した脂質小胞22,23を不安定化させることによって二層形成を誘導している。このAHペプチドを用いて、胎盤細胞を模倣した支持脂質二重層が以前に形成された24.生体医学用途に対するサポート脂質二重層の大きな可能性は、分子およびナノ粒子輸送25、26、環境毒性相互作用27、タンパク質組立および機能17、18、19、ペプチド配置および挿入28、29、薬物スクリーニング30、およびマイクロ流体プラットフォーム31に及ぶ調査で実証されている。

懸濁された脂質二重層は、多孔質疎水性インサート32、33、34、35に脂質二重層が懸濁される平行人工膜透過性アッセイ(PAMPA)を介して医薬スクリーニング試験に使用されている。PAMPA脂質モデルは、血液脳、頬、腸、経皮インターフェース36を含む異なる生物学的インターフェースのために開発された。支持脂質二重層とPAMPAの技術を組み合わせることにより、所望の組織または細胞型の脂質成分内に化合物の吸着、透過性、および埋め込みが徹底的に検討できる。

このプロトコルは、いくつかの分子相互作用を調査するために 、体外 細胞膜脂質二重層モデルの製造と適用について説明する。ユニ脂質とマルチ脂質の両方の調製は、二重層を支持し、懸濁した脂質をサポートし、詳細である。脂質小胞は、脂質二重層を形成するために、まず薄膜水和法および押出法を用いて開発され、その後に物理化学的特徴付けが行われます。PAMPAで使用するための懸濁型脂質膜のQCM-Dモニタリングおよび製造を用いた支持脂質二重層の形成が議論される。最後に、より複雑な細胞模倣膜の発達のための多脂質小胞を調べる。このプロトコルは、両方のタイプの作製脂質膜を使用して、このツールを使用して分子相互作用を研究する方法を示しています。全体的に、この技術は、高い再現性と汎用性を有する脂質二重層を模倣する細胞を構築する。

プロトコル

1. ユニリピッドベシクルの開発

  1. 薄膜ハイドレーション法
    1. 脂質ストック溶液の調製と保存
      注:クロロホルムを使用するすべてのステップは、化学ヒュームフードで行う必要があります。クロロホルムは、常に溶媒安全な炭素繊維ピペットチップを使用して配管する必要があります。クロロホルムを含む溶液は、常にガラスバイアルに保存する必要があります。
      1. 適切な量のクロロホルムを脂質粉末を含むバイアルに加えて10mg/mLの脂質ストック液を調製し、よく混ぜます。例えば、200mgのL-α-ホスファチジルコリン(卵、鶏)(eggPC)に20mLのクロロホルムを加えます。ストック溶液は、必要に応じて異なる濃度で作ることができる。
        注:粉末脂質がアンプルに保存された場合、クロロホルム移動をポリテトラフルオロエチレン(PTFE)が並んだキャップを有するガラスバイアルに添加した。
      2. バイアルキャップをパラフィルムでシールし、-20°Cで6ヶ月間保管してください。
    2. ドライ・脂質フィルムの形成
      1. 2.5 mg/mLの最終的な小胞濃度に必要なクリーンガラスバイアルに適切な量の脂質ストック液を加えます。例えば、2.5mg/mLで卵PC小胞の1mLを形成するために、ピペット250μLの卵PCストック溶液をバイアルに入れる。
        注:準備されたボリュームは、使用されている押出機プロセスに依存する場合があります(ステップ1.3を参照)。小型押出機の最大推奨容積は1mL、大押出機の容積は5~50mLです。
      2. N2ガス(超純度5.0グレード)の流れを用いて、脂質ストック溶液からクロロホルムを除去します。
      3. クロロホルムを完全に除去するために、乾燥した脂質膜を真空に接続し、少なくとも4時間放置します。
        注: このプロセスはここで停止できます。真空乾燥後すぐに脂質フィルムを使用しない場合は、使用するまでデシケータに保管してください。我々は、これらの脂質フィルムがこれらの条件で保存の1週間後に同様の品質の小胞を生み出すことの観察を受けた。必要に応じて、より長いストレージ期間に続く小胞の品質をさらに検討する必要があります。
    3. フリーズ融解渦サイクルの実行
      1. トリスベース10mMと100mMのNaClを含むトリス塩化ナトリウム(NaCl)緩衝液を調製します。乾燥した脂質膜をトリスNaClバッファーの必要量で水分補給し、約15〜30sの最終小胞濃度2.5mg/mLと渦を生成します。
      2. ベシクル懸濁液をドライアイス付き容器に移し、約30分で凍り付けます。試料を完全に凍結した後、30〜40°Cの水浴で懸濁液を解凍する。解凍された小胞懸濁液を渦。
        注:液体N2 はドライアイスの代わりに使用することができます。ベシクル懸濁液を液体窒素に30sの液体窒素に移し、80°Cの水浴ですぐに解凍します。
      3. ステップ 1.1.3.2 をさらに 4 回繰り返し、合計で 5 回のフリーズ融解渦サイクルを実行します。
  2. 押し出し
    注:フリーズ融解ボルテックスサイクルが完了すると、マルチラメラ小胞が形成されます。押出はサイズを小さくし、大きい単層小胞を開発するのを助ける。
    1. ミニ(1 mL)押出機プロセス
      1. 超純水中の中質洗剤を使用して押出機のすべてのコンポーネントを徹底的に洗浄し、超純水で少なくとも3回洗い流し、すべての洗剤を除去します。N2 ガスで乾燥します。
      2. 2つの内部膜サポートとOリング(内径12.7mm、外径15.2mm)を組み立てます。Oリングが上を向いることができるように、各膜支持を配置します。
      3. フィルターサポートを超純水で予水します。Oリングの内側の膜支持面に置きます。2番目の内部膜支持について繰り返します。
      4. 押出機の外側のケーシングに1つの内部膜支持体を置く。100 nmのポリカーボネート膜を、フィルター支持体の上に直接、内部膜支持体の上に置きます。
        注:ポリカーボネート膜は、青色の紙の部分の間に別々に保存されています。膜支持に挿入する前に分離紙を取り外します。
      5. 第2の内部膜支持体を、Oリングとフィルター支持側がポリカーボネート膜に面した押出機外ケースに配置します。PTFEベアリングをリテーナーナットに取り付け、押出機の外側のケーシングでネジを閉じます。押出機を加熱ブロックにクリップします。
      6. 脂質小胞懸濁液を注射器の1つにロードし、注射器を押出機のヒートブロックに配置し、針を押出機の一端に完全に挿入します。2 番目の空のシリンジを反対側に挿入し、ヒートブロックのアーム クリップを使用して両方のシリンジをロックします。
        注:必要に応じて、押出機のヒートブロックをホットプレートに置き、温度を脂質の転移温度より上の値に設定します。温度計をヒートブロックに組み込んだホルダーに挿入して正確な温度測定値を得て、必要な温度に達するまで待ちます(〜15分)。卵PC脂質小胞は、押出し中に熱を必要としません。
      7. 小胞の懸濁液を空のシリンジにゆっくりと押し込み、元の注射器に戻します。漏れを示す押出し全体の圧力変化を監視します。ポリカーボネート膜を通過する合計21回に対してさらに20回繰り返します。脂質小胞を清浄なガラスバイアルに移して保管します。
        注:押し出しの数は、脂質組成に応じて最適化することができます。
      8. 熱を使用した場合は、押出された小胞懸濁液が室温に達することを可能にする。押し出された脂質小胞を4°Cで、さらに使用するまで保管してください。
        注:推奨ベシクルの貯蔵期間は脂質組成に大きく依存し、小胞の物理化学的特性(例えば、流体力学的直径、ゼータ電位)は時間の経過とともに監視されるべきである。例えば、卵PC小胞は、小胞サイズまたは二重層形成能力に変化を伴う少なくとも2週間保存されている。
    2. 大型(5~50 mL)押出機
      注:選択した脂質に熱が必要な場合は、手順1.2.2.1-1.2.2.5に従ってください。熱が必要ない場合は、ステップ1.2.2.5に進みます。ステップ 1.2.2.1-1.2.2.4 は、卵 PC には必要ありません。
      1. 1 L フラスコに逆浸透(RO)水を充填します。
        注:50 mLシステムを通して、金属イオンが押出機のシリンダーから浸出する可能性がありますので、超純水を使用しないでください。
      2. ホットプレートの水浴に1Lフラスコを置き、ホットプレートを脂質の転移温度以上の温度に設定します。
      3. サンプルシリンダーの入口を介してフレキシブルチューブでフラスコにサンプルシリンダーを取り付けます。シリンダーの出口にチューブを1 Lフラスコの上部に取り付けます。必要に応じて、入口と出口の両方でしっかりとしたチューブ。これにより、サンプルシリンダを通る水の単方向フローが作成されます。
      4. ポンプをオンにして水循環を開始します。熱が必要な場合は、サンプルシリンダーが所望の温度に達するまで約30〜45分かかります。
      5. 圧力リリーフバルブユニットに取り付けられたフレキシブルコネクタを介して、サンプルシリンダーのキャップを窒素タンクに接続します。
      6. 50 mL 押出機の全パーツを70%(v/v)エタノールで洗浄します。
      7. 押出機下部支持体のスペースに大穴スクリーン支持体、焼結ディスク、ドレインディスク、ポリカーボネート膜を配置して押出機を組み立てます。4本のネジを使用して押出機の上下支持を接続し、締め付けします。
      8. 下にねじ込み、レンチで締めて、サンプルシリンダーに押出機ユニットを取り付けて固定します。
        注:熱を使用する場合は、温度計をシリンダーに入れ、水が希望の温度に達するまで待ってから続行してください。これにより、押し出しプロセス全体を通してサンプル温度が維持されます。
      9. サンプルシリンダーに超純水を充填します。サンプルをサンプルシリンダーに追加する前に、押出機ユニットを通して水を押し出します。これは、ミニ押出機と同様に、膜を事前に濡らすために行われます。
        注:キャップが完全にねじ込まれ、窒素をオンにする前に圧力リリーフバルブが完全に閉じられていることを確認してください。このステップ(〜5-10 psi)に必要な圧力は最小限である。
      10. 脂質ベシクル懸濁液をサンプルシリンダーに加え、上部を閉じます。サンプルが約2〜3滴/sの速度で押出機ユニットからきれいなガラスバイアルに滴り始めるまで、ゆっくりと圧力を高めます。
        注:圧力が大きすぎると膜に悪影響を与え、押し出しが失敗する可能性があるため、このステップで圧力を速く増やしないでください。
      11. すべてのサンプルが押し出されたら、N2 電源をオフにして、圧力リリーフバルブをゆっくりと開けてサンプルシリンダーの圧力を解放します。脂質小胞をサンプルシリンダーに戻し、ステップ1.2.2.11を繰り返し、合計10回の押出しをさらに9回繰り返します。
        注: 押出に必要な圧力は、サンプルがより均質になり、ポリカーボネート膜孔のサイズに近くなるにつれて、押出の数が増えるにつれて減少する可能性があります。
      12. 押し出しされた脂質ベシクル懸濁液は、さらに使用されるまで4°Cで保管してください。

2. 脂質小胞の特徴

  1. ダイナミック光散乱(DLS)を用いた流体力学的直径測定
    1. 渦液脂質小胞およびピペット50 μLの脂質小胞懸濁液を使い捨て少量キュベットに。ほこりやごみによる汚染を防ぐためのカバー。
    2. 小胞サスペンションをDLS計測器にロードし、サンプルの詳細を入力し、関連するソフトウェアを使用して測定を実行します。
  2. ゼータの可能性
    1. 超純水、70%エタノール、超純水でセルの入力に接続する注射器を使用して洗浄することにより、折り畳まれた毛細管ゼータ細胞を準備します。液体をセルに3~4回軽く押し込み、セルを完全に空にしてから次の溶液に切り替えます。
    2. 脂質小胞をボルテックスし、超純水中の脂質小胞の1:10(v/v)希釈を調製する。
    3. 希釈した脂質ベシクル懸濁液をロードします。シリンジの間でサスペンションを前後に押し出して気泡を取り除く。ストッパーを各入口に取り付けます。
      注:測定に影響を与えるため、すべての気泡を除去することが重要です。
    4. ゼタセルをサンプルチャンバーに入れ、電極が接触していることを確認します。サンプルチャンバー上部を閉じます。関連ソフトウェアで、サンプルの詳細を入力し、測定を収集します。

3. QCM-Dを用いたユニ脂質支持脂質二重層の形成

  1. ソリューションの準備
    1. 2%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液を超純水で調製します。完全に溶解するまでかき混ぜるプレートに混ぜます。アリコートは、少なくとも10 mLの超純水、2%SDS、トリスNaClの作業ソリューションです。
    2. トリスNaClバッファーに脂質小胞の希釈を準備します。小胞の濃度は、アプリケーションに依存します。卵PCの場合、0.01〜0.5mg/mLの範囲の濃度は、脂質二重層形成に成功することが示されている。
  2. シリカコーティングされた水晶センサーの洗浄
    メモ: クリーニングQCM-Dの結晶は使用されるセンサーの表面材料に依存する。サポートされる脂質二重層を形成するために、シリカコーティングされた水晶結晶は、このプロトコルで使用され、メーカーの標準的な操作手順から適応されるように、以下に詳述されています。
    1. シリカコーティングされた水晶センサーをフローモジュールに挿入して、水晶の「t」がモジュールの「t」と一致していることを確認します。フローモジュールを閉じます。
      注: 使用される QCM-D で複数のフロー モジュールを接続して同時に実行できる場合は、必要に応じて追加のモジュールについて次の手順を繰り返します。
    2. フローモジュールをアナライザシステムに接続するフローモジュールの電極で、機器のベースに挿入します。モジュールを所定の位置にロックします。
    3. 流入口と出口チューブをフローモジュールとポンプに接続します。チューブを保持ガードに入れ、アナライザーシステムの蓋を閉じます。ポンプの出口に廃棄物容器を置き、使用済みのソリューションを収集します。
    4. クリーニングを行う場合は、まずポンプをオンにします。流速を400 μL/minに設定します。入口チューブを超純水に挿入し、モジュールを通して5〜10 mLを流します。
    5. 入口チューブを2%SDSに切り替え、モジュールを通して5〜10 mLを流します。入口チューブを超純水に戻し、モジュールを通して10〜20 mLを流します。溶液から入口チューブを取り出し、すべての液体が排出されるまでチューブを通して空気を流します。
      注: 上記のクリーニング プロトコルは、測定の前後に毎日使用されます。必要に応じて徹底した清掃が可能です。簡単に説明すると、徹底的なクリーニングを実行するには、フローモジュールを分解します。フローモジュールの電極側を除くすべてのコンポーネントは、2%(w/v)SDSに浸漬し、浴を超音波処理し、続いて超純水で徹底的にすすいで、N2 ガスの流れを乾燥させる必要があります。電極ピンを含むフローモジュールのコンポーネントは、液体と接触してはいけません。
    6. フローモジュールからセンサーを取り外し、超純水でセンサーをすすきます。N2 気体でセンサーを乾燥させます。フローモジュールをN2 ガス流で乾燥させます。電極は常に液体の自由を保つことを確認します。
    7. 化学ヒュームフードで、シリカコーティングされた水晶センサーを紫外線(UV)/オゾンクリーニング器具に挿入します。器械をオンにして、少なくとも2分間の処置を可能にする。センサーを慎重に取り外し、フローモジュールに戻ります。
  3. トリス NaCl ベースラインの形成
    1. アナライザー装置をオンにして、関連するソフトウェアに接続し、サポートされている脂質二重層の所望の値に温度を設定します。温度が目的の入力に安定するようにします。
      注:設定温度が室温以上の場合、すべての溶液をヒートブロックを使用して同じ温度に加熱する必要があります。
    2. 測定を開始する前に、測定を構成し、倍音3、5、7、9、11、および13の全センサ共振周波数と放散を見つけます。
      注: この高調波は過度に敏感で、騒がしいデータを生成するので、1番目 の倍音は無視できます。
    3. ポンプの電源を入れ、流量を175 μL/minまたは所望の実験流量に設定します。
    4. トリスNaClに挿入する前に、エタノールで入口チューブを拭きます。測定を開始し、トリスNaClの流れを開始します。
      注: データはリアルタイムで収集および監視されます。フローモジュール内の空気から液体への変化は、急激な散逸変化(ΔD)の増加と周波数変化(ΔF)減少によってデータ収集ソフトウェアで観察されます。
    5. Tris NaClがモジュールを5〜10分間流れるようにして、液体中のベースライン ΔF と ΔD 値が安定していることを確認します。
  4. ユニ脂質支持脂質二重層の形成
    1. ポンプを停止し、トリスNaCl溶液から入口チューブを取り出し、慎重に脂質ベシクル溶液に挿入します。5 sのバックフローは、入口チューブから気泡を取り除き、次に前方流れを続けます。ベースラインをゼロにしてソフトウェアの測定を再開します。
      注:モジュールを通って流れ、二重層形成とデータ記録を妨害するチューブ内の気泡を避けるように注意してください。
    2. 二重層形成がデータ取得ソフトウェアでリアルタイムに観察されるまでの脂質小胞の流れ (卵PC小胞の場合は少なくとも 8 分)。
    3. ステップ 3.4.1 を繰り返して、脂質小胞からの入口チューブを Tris NaCl バッファーに戻します。
      注: 必要なアプリケーションが分子相互作用を研究する場合は、直接ステップ 6.1 に進み、ソリューションフローやデータ取得を停止します。二重層形成が終点である場合は、ステップ 3.4.4 に進みます。
    4. ソフトウェアで、測定を停止し、ファイルを保存します。ポンプを停止します。
    5. プロトコルステップ3.2.4および3.2.5に従って流れモジュールおよびシリカコーティングされた水晶体センサーをきれいにしなさい。

4. 懸濁した脂質二重層の形成

注:浮遊脂質二重層を形成するためのプロトコルは、フィルタプレートメーカー37によって提供される並列人工膜透過性アッセイ(PAMPA)プロトコルから適応される。

  1. 20 mg/mL で所望の脂質をドーデカンに可溶化する (例えば, 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DOPC)).
  2. 脂質溶液の5 μLをドナーコンパートメントに加え、多孔質ポリビニリデンジフッ化物(PVDF)96ウェルマルチスクリーンフィルタープレート(0.45 μmの気孔サイズ)です。
  3. すぐにフィルタープレートをアクセプタコンパートメントに浸し、× 300 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の300 μLを含む輸送受信機プレートである。ドナーコンパートメントに200μLの1×PBSを加えます。
    注:1×PBSに曝露された脂質のみ及び未処理のフィルターを有するフィルタの制御が含まれる場合がある。
  4. セクション6.2に直接進み、懸濁した脂質二重層との分子相互作用を調査する。中断された二重層を形成してから16時間以内に研究を完了することをお勧めします。

5. 小胞と二重層を模倣する多脂質細胞の開発

  1. 哺乳動物細胞からの脂質抽出
    注:脂質抽出は、ブライダイアーアプローチ38に従います。
    1. 必要な細胞株を適宜培養する。70~80%合流(T75フラスコ)を達成した後、トリプシン-エチレンアミントレ酢酸を使用して細胞を37°Cで5分間剥離します。
    2. 遠心分離細胞200×gで5分間。上清を取り除き、細胞ペレットを1mLの超純水で再懸濁します。
    3. クロロホルム:メタノールの1:2(v/v)混合物を細胞懸濁液に3.75mL、ボルテックスを15分間加えます。その後、クロロホルムと渦を1分間1.25mL加えます。最後に、1.25 mLの水と渦を1分間加えます。
    4. 遠心分離細胞混合物を1000xgで10分間混合した。有機相に脂質を含む液体の底層を収集します。N2ガスの流れの下で乾燥する。
    5. C18逆相、3.5 μmの×50mmカラムを用いて、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)を用いて脂質含有量を定量化します。
    6. 移動相の場合は、60:40(v/v)アセトニトリル:水で2つの溶液を準備し、2番目の溶液は90:10(v/v)イソプロパノール:アセトニトリルで準備します。アンモニウムの定量は、最終的な濃度10 mMで両方の溶液に添加する必要があります。60 min 以上で、2 番目のソリューションの 35% (v/v) から 95% (v/v) に移動相勾配を増やします。
    7. 連続的なフルスキャンMSとタンデムMS/MSで、負のイオン化モードで流出を検出します。LIPID MAPS 質量分析ツールを使用して、衝突によって起こされた解離断片化の質量スペクトルを分析します。抽出したイオンクロマトグラムを得て、その領域を曲線下に集積し、各脂質種の存在量を決定する。
    8. 主要な脂質クラスを含む脂質標準のステップ 5.1.5-5.1.7 を実行して、異なるリン脂質クラスごとに検出の相対的な感受性を決定します。
  2. 多脂質小胞の開発
    1. ステップ5.1で特定されるように、各所望の二重層成分を表す脂質に対する脂質ストック溶液を調製するために1.1.1のステップに従ってください。
    2. ステップ5.1から得られた脂質組成物に基づいて、2.5mg/mLの最終的な小胞濃度に必要なきれいなガラスバイアルに脂質/クロロホルムストックの適切な量を追加します。N2ガスの流れの下でバルククロロホルム乾燥溶液を除去する。
    3. ステップ 1.1.2、 1.1.3、および 1.2 に従って、多脂質小胞を形成します。ベシクルの特性評価については、手順 2 に従います。
  3. QCM-Dを用いた多脂質支持脂質二重層の形成
    注:いくつかの多脂質小胞は、ステップ3で提示ユニ脂質PC小胞と同様に自発的な脂質小胞破裂および二重層形成をもたらすことができます。しかし、より複雑な多脂質小胞は、小胞破裂を助けるために外部入力を必要とするかもしれない。ここで、AHペプチドは、二重層形成をもたらす小胞の外葉を不安定化させるために使用される。不安定化および小胞破裂を達成する他の方法は、必要に応じて考慮されてもよい。
    1. ステップ3に従って、ステップ5.2で形成された多脂質小胞を利用して多脂質支持脂質二重層を形成する。
    2. 二重層への小胞の自発的な破裂が見られない場合、AHペプチドを用いて小胞不安定化を試みる。AHペプチドを準備する(ペプチド配列: H-Ser-Gly-Ser-Trp-Leu-Arg-Asp-Val-Trp-Asp-Trp-Trp-Ile-Cys-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Lys-Thr トリスNaClで13 μMで1%(v/v)ジメチルスルホキシド、DMSOを使用して-Trp-Leu-Glu-Gln-Ser-Lys-Leu-E-Asp-Tyr-Lys-Asp-NH2)溶液。
    3. 手順 3.4.1~3.4.3 に従ってください。ステップ3.4.3の後、インレットチューブをAHペプチド溶液に変える。新しい溶液の追加から ΔF と ΔD が観察されるまで、フローモジュールにソリューションを導入します。ポンプを停止し、AHペプチドが10分間小胞でインキュベートできるようにします。
    4. 入口チューブをTris NaClに切り替え、脂質二重層の形成に成功につながる破裂した小胞からAHペプチドを除去するために流れを開始する。
      注:必要なアプリケーションが分子相互作用を研究する場合は、ソリューションフローやデータ取得を停止することなく、ステップ6.1への方向を続けてください。
    5. ソフトウェアで、測定を停止し、ファイルを保存します。ポンプを停止します。
    6. プロトコルステップ3.2.4-3.2.6に従って流れモジュールおよびシリカコーティングされた水晶センサーをきれいにしなさい。
  4. 懸濁された多脂質二重層
    1. 20 mg/mL でドーデカンで所望の脂質の混合物を可溶化します。.
    2. 望ましい細胞模倣組成物を使用して5μLの脂質混合溶液を構成する。
    3. 手順 4.2 と 4.3 に従います。
      注:ステップ6.2に直接進み、懸濁した脂質二重層との分子相互作用を調査します。

6. 分子相互作用研究ユニ-脂質と多脂質二重層

  1. QCM-Dを用いた脂質二重層との分子相互作用の研究
    1. 目的の分子の溶液を調製し、支持された脂質二重層で吸着を調べる。例えば、トリスNaClに200 μM di(2-エチルヘキシル)フタル酸(DEHP)の溶液を1%(v/v)DMSOで調製します。
    2. 分子溶液がTris NaClで調製される場合、それは、単脂質二重層の場合はステップ3.4.3に直接、または多脂質二重層の場合は5.3.4に続いて流すことができる。分子を別の溶媒で調製する必要がある場合は、代わりに少なくとも5分間、所望の溶媒に入口チューブを挿入します(例えば、DEHP用に1%(v/v)DMSOを有するTris NaCl。
      注:溶剤による粘度変化は、対象分子の導入前後に流すことで監視・検討が可能です。
    3. インレットチューブを、対象の分子を含む溶液に切り替え、少なくとも5分間流れます。また、流れは、所望の分子を含む液体を必要に応じて二重層と共にインキュベートしてもよい。
    4. トリスNaCl以外の場合は、インレットチューブを分子溶媒だけに戻します。少なくとも5分間流れる。次に、入口チューブをトリスNaClに切り替え、少なくとも5分間流します。
    5. ソフトウェアで、測定を停止し、ファイルを保存します。ポンプを停止します。
    6. プロトコルステップ3.2.4-3.2.6に従って流れモジュールおよびシリカコーティングされた水晶センサーをきれいにしなさい。
  2. PAMPAを用いた懸濁脂質二重層との分子相互作用の研究
    1. 目的の分子の溶液を準備します。例えば、1%(v/v)DMSO を使用して1× PBS で 200 μM DEHP を準備します。
    2. 新しい搬送レシーバプレートを、1ウェルあたり300 μLの新鮮な1x PBSで準備します。
    3. ステップ3.3の直後に、ユニ脂質懸濁二重層の場合は4.4.3、またはマルチリピッド懸濁二重層の場合は、マルチスクリーンフィルタープレートのドナー区画から1×PBSを取り除き、試験溶液の200 μLに置き換えます。ステップ6.2.2で準備された輸送受信機プレートに直ちに沈水する。
    4. 25°Cで所望の時間(例えば、2時間)の穏やかな揺れでインキュベート。
    5. インキュベーション後、ドナーおよびアクセクサコンパートメントから溶液の150 μLを収集します。この分子の特性に基づいて適切な方法を用いて、両方のサンプル中の分子濃度を測定する。
      1. 例えば、DEHP用に280nmのような適切な吸光度波長を有するマイクロプレート分光光度計を用い、目的の分子の標準曲線と比較する。
    6. 次の式を使用して、対象分子の見かけの透過性 (Pアプリ) を計算します。
      figure-protocol-12370 (1)
      どこ figure-protocol-12447 (2)
      注:[試験化合物]アクセプタ は、アクセプタコンパートメント内の時間、t、時間における関心のある分子(例えば、DEHP)の濃度です。[試験化合物]初期 は分子の初期濃度である。Aは膜領域、tは時間、VD はドナーコンパートメント容積、VA はアクセプタコンパートメント容積である。

結果

このプロトコルは、サポートされている脂質二重層を形成するための方法を詳述する(図1)。サポートされる脂質二重層を形成するための最初のステップは、脂質小胞を開発することです。小型押出機は少量の脂質小胞を調製することを可能にする(1mL以下)、大きい押出機は1つのバッチで調製される脂質小胞の5-50 mLを可能にする。ミニまたは大型押出機のいずれかによっ...

ディスカッション

このプロトコルは、脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層の形成を可能にする。ここでは、これらの構造を形成するための重要なステップを示します。脂質小胞を形成する場合、脂質39の転移温度を超えて押し出することが重要である。転移温度を下回ると、脂質は、その秩序ゲル相39に物理的に存在する。この順序付けられた段階では...

開示事項

著者らは、利益相反や競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この資料は、A.S.に授与されたグラント・ノー・1942418の下で国立科学財団が支援する仕事と、グラント・No.1644760の下でC.M.B.H.に授与された国立科学財団大学院研究フェローシップに基づいています。この資料で表明された意見、調査結果、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。著者らは、ノエル・ベラ・ゴンサレス博士の脂質ベシクル特徴付けデータ取得に感謝する。著者らは、彼のゼータサイザーの使用のためにロバート・ハート教授(ブラウン大学)に感謝します。著者らは、ブラウン大学質量分析施設、特にTun-Liシェン博士に脂質組成の定量化に関する支援を受け付けたことに感謝している。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC)Avanti Polar Lipids850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)Avanti Polar Lipids840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)Avanti Polar Lipids850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)Avanti Polar Lipids840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE)Avanti Polar Lipids850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))Avanti Polar Lipids890703
3 mL Luer-Loc syringesBD309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber linerDuran Wheaton KimbleW224605
AcetonitrileSigma-Aldrich271004
AlconoxFisher Scientific50-821-781
Ammonium formateMillipore SigmaLSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFireWaters 186002551
ChloroformMillipore SigmaLSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPKSarstedt67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)Millipore Sigma36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore SigmaLSAC472301
EthanolPharmco111000200
Filter supports, 10 mmAvanti Polar Lipids610014Size for mini extruder
Folded capillary zeta cellMalvern PanalyticalDTS1070
IsopropanolSigma-Aldrich190764-4L
KimwipesKimberly Clark34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)Avanti Polar Lipids840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids840051
LiposoFast ® LF-50Avestin, Inc.
MethanolSigma-Aldrich179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating blockAvanti Polar Lipids610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterileMillipore SigmaMAIPS4510for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapureTechAirNI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 umWhatman800309Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 umWhatman110605Size for large extruder
ParafilmBemisPM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10xGenesee Scienfitic25-507XDilute to 1x
Qsoft 401 softwareBiolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense AnalyzerBiolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mLDuran Wheaton Kimble986561
Silicon Dioxide, thin QSensorsBiolin ScientificQSX 303
Sodium chloride (NaCl)Millipore SigmaLSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Fisher ScientificBP166-100
Solvent Safe pipette tipsSigma-AldrichS8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids860061
Trizma baseMillipore SigmaLSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acidCaisson LabsTRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mmWhatman230600Size for large extruder
Zetasizer ZS90Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 softwareMalvern Panalytical

参考文献

  1. Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
  2. Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as a mediator for small molecule interaction with membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1858 (10), 2290-2304 (2016).
  3. Bunea, A. I., Harloff-Helleberg, S., Taboryski, R., Nielsen, H. M. Membrane interactions in drug delivery: Model cell membranes and orthogonal techniques. Advances in Colloid and Interface Science. 281, 102177 (2020).
  4. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: Applications in drug discovery and drug delivery. Molecular Pharmaceutics. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  5. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of Lipid Vesicle Deposition on Solid Surfaces: A Combined QCM-D and AFM Study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  6. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: Effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  7. Mingeot-Leclercq, M. -. P., Deleu, M., Brasseur, R., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy of supported lipid bilayers. Nature protocols. 3 (10), 1654-1659 (2008).
  8. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  9. Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  10. Edvardsson, M., Svedhem, S., Wang, G., Richter, R., Rodahl, M., Kasemo, B. QCM-D and reflectometry instrument: applications to supported lipid structures and their biomolecular interactions. Analytical chemistry. 81 (1), 349-361 (2009).
  11. Rodahl, M., et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion. Faraday Discussions. 107, 229-246 (1997).
  12. Keller, C. A., Glasmästar, K., Zhdanov, V. P., Kasemo, B. Formation of Supported Membranes from Vesicles. Physical Review Letters. 84 (23), 5443-5446 (2000).
  13. Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical journal. 75 (3), 1397-1402 (1998).
  14. Cho, N. -. J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature protocols. 5 (6), 1096-1106 (2010).
  15. Bailey, C. M., Tripathi, A., Shukla, A. Effects of Flow and Bulk Vesicle Concentration on Supported Lipid Bilayer Formation. Langmuir. 33 (43), 11986-11997 (2017).
  16. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature reviews. Molecular cell biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  17. Rossi, C., Chopineau, J. Biomimetic tethered lipid membranes designed for membrane-protein interaction studies. European Biophysics Journal. 36 (8), 955-965 (2007).
  18. Hatty, C. R., et al. Investigating the interactions of the 18 kDa translocator protein and its ligand PK11195 in planar lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (3), 1019-1030 (2014).
  19. Min, Y., Kristiansen, K., Boggs, J. M., Husted, C., Zasadzinski, J. a., Israelachvili, J. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3154-3159 (2009).
  20. Heath, G. R., et al. Layer-by-layer assembly of supported lipid bilayer poly-l-lysine multilayers. Biomacromolecules. 17 (1), 324-335 (2016).
  21. Alberts, B., Lewis, J. The Lipid Bilayer. Molecular Biology of the Cell. , 6-11 (2013).
  22. Cho, N. J., Wang, G., Edvardsson, M., Glenn, J. S., Hook, F., Frank, C. W. Alpha-helical peptide-induced vesicle rupture revealing new insight into the vesicle fusion process as monitored in situ by quartz crystal microbalance-dissipation and reflectometry. Analytical Chemistry. 81 (12), 4752-4761 (2009).
  23. Hardy, G. J., Nayak, R., Munir Alam, S., Shapter, J. G., Heinrich, F., Zauscher, S. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by α-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22 (37), 19506-19513 (2012).
  24. Bailey-Hytholt, C. M., Shen, T. L., Nie, B., Tripathi, A., Shukla, A. Placental Trophoblast-Inspired Lipid Bilayers for Cell-Free Investigation of Molecular Interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (28), 31099-31111 (2020).
  25. Domenech, O., Francius, G., Tulkens, P. M., Van Bambeke, F., Dufrêne, Y., Mingeot-Leclercq, M. -. P. Interactions of oritavancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers: Effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization. Biochimica et biophysica acta. 1788 (9), 1832-1840 (2009).
  26. Bailey, C. M., Kamaloo, E., Waterman, K. L., Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. a. Size dependence of gold nanoparticle interactions with a supported lipid bilayer: A QCM-D study. Biophysical Chemistry. 203-204, 51-61 (2015).
  27. Bailey-Hytholt, C. M., Puranik, T., Tripathi, A., Shukla, A. Investigating interactions of phthalate environmental toxicants with lipid structures. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 190, 110923 (2020).
  28. Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Antimicrobial peptide alamethicin insertion into lipid bilayer: a QCM-D exploration. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 116, 472-481 (2014).
  29. Lozeau, L. D., Rolle, M. W., Camesano, T. A. A QCM-D study of the concentration- and time-dependent interactions of human LL37 with model mammalian lipid bilayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167 (1), 229-238 (2018).
  30. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  31. Ren, X., et al. Design, fabrication, and characterization of archaeal tetraether free-standing planar membranes in a PDMS-and PCB-based fluidic platform. ACS Applied Materials & Interfaces. 6 (15), 12618-12628 (2014).
  32. Seo, P. R., Teksin, Z. S., Kao, J. P. Y., Polli, J. E. Lipid composition effect on permeability across PAMPA. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 29 (3-4), 259-268 (2006).
  33. Avdeef, A. The rise of PAMPA. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 1 (2), 325-342 (2005).
  34. Avdeef, A., Artursson, P., Neuhoff, S., Lazorova, L., Gråsjö, J., Tavelin, S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA method. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 24 (4), 333-349 (2005).
  35. Campbell, S. D., Regina, K. J., Kharasch, E. D. Significance of Lipid Composition in a Blood-Brain Barrier-Mimetic PAMPA Assay. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 437-444 (2014).
  36. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  37. Schmidt, D., Lynch, J. Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permation Assays (PAMPA). EMD Millipore Corporation. , (2020).
  38. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  39. Nayar, R., Hope, M. J., Cullis, P. R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholines by extrusion technique. BBA - Biomembranes. 986 (2), 200-206 (1989).
  40. Lind, T. K., Skida, M. W. A., Cárdenas, M. Formation and Characterization of Supported Lipid Bilayers Composed of Phosphatidylethanolamine and Phosphatidylglycerol by Vesicle Fusion, a Simple but Relevant Model for Bacterial Membranes. ACS Omega. 4 (6), 10687-10694 (2019).
  41. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  42. Bermejo, M., et al. PAMPA-a drug absorption in vitro model: 7. Comparing rat in situ, Caco-2, and PAMPA permeability of fluoroquinolones. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (4), 429-441 (2004).
  43. Kerns, E. H., Di, L., Petusky, S., Farris, M., Ley, R., Jupp, P. Application of parallel artificial membrane permeability assay and Caco-2 permeability. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (6), 1440-1453 (2004).
  44. Masungi, C., et al. Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) combined with a 10-day multiscreen Caco-2 cell culture as a tool for assessing new drug candidates. Pharmazie. 63 (3), 194-199 (2008).
  45. Vera-González, N., et al. Anidulafungin liposome nanoparticles exhibit antifungal activity against planktonic and biofilm Candida albicans. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (11), 2263-2276 (2020).
  46. Barenholz, Y., Gibbes, D., Litman, B. J., Goll, J., Thompson, T. E., Carlson, F. D. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (1), 2806-2810 (1977).
  47. El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1798 (4), 750-765 (2010).
  48. Tawa, K., Morigaki, K. Substrate-supported phospholipid membranes studied by surface plasmon resonance and surface plasmon fluorescence spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (4), 2750-2758 (2005).
  49. Koenig, B. W., et al. Neutron Reflectivity and Atomic Force Microscopy Studies of a Lipid Bilayer in Water Adsorbed to the Surface of a Silicon Single Crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  50. Lind, T. K., Cárdenas, M. Understanding the formation of supported lipid bilayers via vesicle fusion-A case that exemplifies the need for the complementary method approach (Review). Biointerphases. 11 (2), 020801 (2016).
  51. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  52. Isaksson, S., et al. Protein-Containing Lipid Bilayers Intercalated with Size-Matched Mesoporous Silica Thin Films. Nano Letters. 17 (1), 476-485 (2017).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved