מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

Summary

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לניתוח אינטראקציות בין מארח למיקרוביום באמצעות מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניסויים ex vivo.

Abstract

המבנה של רקמת המעי מאפשר אינטראקציות קרובות והדדיות בין הפונדקאי למיקרוביוטה במעיים. שיחות צולבות אלה חיוניות לשמירה על הומאוסטזיס מקומי ומערכתי; שינויים בהרכב המיקרוביוטה במעיים (דיסביוזיס) מקשרים למגוון רחב של מחלות אנושיות. שיטות לנתח אינטראקציות בין מארח למיקרוביוטה מקיפות החלפה אינהרנטית בין שימור מבנה הרקמה הפיזיולוגית (בעת שימוש במודלים של בעלי חיים של vivo) לבין רמת השליטה על גורמי הניסוי (כמו במערכות פשוטות בתרבית תאי חוץ גופיה). כדי לטפל בהחלפה זו, Yissachar ואח ' פיתחו לאחרונה מערכת תרבית איברי מעיים. המערכת משמרת בניית רקמת המעי הגס הנאיבית ומנגנונים תאיים והיא גם מאפשרת שליטה ניסיונית הדוקה, ומאפשרת ניסויים שלא ניתן לבצע בקלות ב- vivo. זה אופטימלי לנתח תגובות לטווח קצר של רכיבי מעיים שונים (כגון אפיתל, אלמנטים אימונולוגיים ונוירולוגיים) כדי הפרעות זוהר (כולל חיידקים אנאירוביים או אירוביים, דגימות מיקרוביוטה שלמות מעכברים או בני אדם, תרופות ומטבוליטים). כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של פרוטוקול ממוטב לתרבות איברים של שברי מעיים מרובים באמצעות מכשיר תרבות מעיים מותאם אישית. תגובות מארחות להפרעות זוהרות יכולות להיות חזותיות על ידי כתמים אימונופלואורסצנטיים של מקטעי רקמות או שברי רקמות של הר שלם, הכלאה פלואורסצנטית במקום (FISH), או הדמיה לשגות זמן. מערכת זו תומכת במגוון רחב של קריאות, כולל רצף הדור הבא, ציטומטריית זרימה וביקורים תאיים וביוכימיים שונים. בסך הכל, מערכת תרבית איברים תלת ממדית זו תומכת בתרבות של רקמות מעיים גדולות ושלמות ויש לה יישומים רחבים לניתוח ברזולוציה גבוהה והדמיה של אינטראקציות בין מארח למיקרוביוטה בסביבת המעיים המקומית.

Introduction

המעי הוא איבר מורכב ביותר המכיל מגוון רחב של סוגי תאים (תאי אפיתל, תאי מערכת החיסון, נוירונים ועוד) המאורגן במבנה מסוים המאפשר לתאים לקיים אינטראקציה ולתקשר זה עם זה ועם התוכן הלומינלי (מיקרוביוטה, מזון וכו '). ^1.נכון לעכשיו, ארגז הכלים המחקרי הזמין לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה כולל תרביות תאים במבחנה ומודלים של בעלי חיים ב- vivo ². מודלים של בעלי חיים ב-Vivo מספקים בניית רקמות פיזיולוגיות^3, אך עם שליטה ניסיונית לקויה ויכולת מוגבלת לתפעל את תנאי הניסוי. במערכות תרבית במבחנה, לעומת זאת, להשתמש בתאים ראשוניים או קווי תאים שניתן להשלים עם חיידקים⁴, המציע שליטה הדוקה על הפרמטרים הניסוי אבל חסר את המורכבות התאית ואת ארכיטקטורת הרקמות. בדיקות במבחנה מודרניות מאפשרות שימוש מתקדם בדגימות רקמה אנושית בריאה ופתולוגית, כמו אורגנוידים אפיתל שמקורם בעכבר או ממקורות אנושיים^5,6, ודגימות המחקות את המיקרו-סביבה הרירית⁷. דוגמה נוספת היא "המעיים על שבב" assay, הכולל את קו התא אפיתל המעי הגס האנושי (Caco2), מטריצה חוץ תאית וערוצים microfluidic לחקות את המצב הפיזיולוגי של invariant^{המעיים 8}. עם זאת, מתקדם וחדשני כמו דגימות במבחנה עשוי להיות, הם אינם שומרים על ארכיטקטורת רקמות נורמלית או הרכב תאי נאיבי.

כדי להתמודד עם זה, Yissachar ואח ' פיתחו לאחרונה מערכת תרבות איברים ex vivo ⁹ (איור 1) השומרת על שברי מעיים שלמים ex vivo,נהנה מהיתרונות של הן ב- vivo והן במודלים במבחנה. מערכת זו של תרבית איברי המעיים ex vivo מבוססת על התקן תרבות מותאם אישית התומך בתרבית מולטיפלקסים של שש רקמות המעי הגס, ומאפשר לבחון תשומות ניסיוניות בתנאים דומים תוך שליטה על התשומות והתפוקות של המערכת. עבודות אחרונות הוכיחו כי מערכת זו היא בעלת ערך לניתוח תגובות מעיים לחיידקי מעיים בודדים 9 ,^דגימותמיקרוביוטה אנושיות שלמות¹⁰ ומטבוליטים מיקרוביאליים¹¹. מערכת זו מאפשרת, לראשונה, לחקור את האינטראקציות המוקדמות בין המארח למיקרוביוטה עם רמה גבוהה של שליטה על הרכיבים המארחים, המיקרוביאליים והסביבתיים. יתר על כן, הוא מאפשר ניטור ומניפולציה של המערכת לאורך כל הניסוי, בזמן אמת.

איור 1: שרטוטים של מכשיר תרבות המעיים. שבר רקמת מעיים שלם מחובר ליציאות היציאה והקלט של התא (למעלה), עם משאבות המסדירות את הזרימה הבינונית בתוך הלומן ובתא הבינוני החיצוני. המכשיר כולו (התחתון) מכיל 6 תאים כאלה. נתון זה שונה מישאר ואח' 2017. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

פרוטוקול זה תואם את הנחיות הטיפול בבעלי חיים שאושרו על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי החיים.

1. הכנת ניסוי

1. ייצור של מכשיר תרבות איברי המעיים (3 ימים)
   1. באמצעות מדפסת תלת-ממד, הדפס את תבניות הפלסטיק הניתנות לשימוש חוזר עבור התקן תרבות האיברים (להתקן יש 6 בארות, עם 24 חורים קטנים וגדולים, ולכסה כיסוי המכשיר) (קבצים תלת-ממדיים מצורפים).
      הערה: תבניות פלסטיק אלה עשויות לשמש לייצור מכשירים רבים.
   2. הכנס את המחטים קהות הקצה (22 G ו 18 G) למיקום המתאים בתוך תבנית המכשיר ויצוק כ 20 גרם של תערובת polydimethylsiloxane (PDMS) (יחס משקל 1:10, בסיס לזרז) עבור קבוצה אחת של המכשיר והמכסה.
   3. מניחים את התבניות בתא ואקום למשך 30 דקות, כדי להסיר בועות אוויר מתערובת PDMS.
   4. לדגור את התבניות ב 55 °C (55 °F) לילה, כדי להשלים PDMS פילמור.
   5. כאשר PDMS מוגדר, לשלוף את המחטים מן התבנית בזהירות לשחרר את מכשיר התרבות ואת המכסה מן תבניות פלסטיק.
   6. הסר שאריות PDMS מקווי המתאר של הבאר באמצעות להב כירורגי. חברו את התקן ה-PDMS ואת כיסוי המכשיר לכוס כיסוי (75 מ"מ x 50 מ"מ מיקרו שקופיות) באמצעות דבק סיליקון לא רעיל והותיר את החלקים מוגדרים למשך הלילה (החל את הדבק על הצד החלק של המכשיר).
   7. הכנס 12 מחטים 22 G עבור לומן ו12 18 G מחטים עבור הבאר. תקן את כל המחטים במקום באמצעות סיליקון ולתת לו להגדיר בן לילה. הכנס שתי מחטי 18 G לתוך מכסה הכיסוי לזרימת אוויר נכונה פנימה והחוצה של מכשיר תרבות איברי המעיים.
   8. בדוק את כל המחטים לדליפות באמצעות מזרק מלא מים. בדוק כי אין דליפה מן בארות על ידי מילוי בארות במים.
   9. הנח שני קשרים כירורגיים על כל מחט 22 G כי יהיה מחובר המעי הגס. מניחים את ההתקן והמכסה בשקית נייר אוטומטית ומעקרים בהפעלה אוטומטית.
2. מדיום תרבות (0.5 שעות)
   1. בברדס ביולוגי, לערבב את הדברים הבאים (בצינור 50 מ"ל): 37 מ"ל של מדיום Dulbecco שונה של Iscove (IMDM), 10 מ"ל של החלפת סרום KSR, 1 מ"ל של תוסף B27, 0.5 מ"ל של תוסף N2, 0.5 מ"ל של 1 M HEPES חוצץ, ו 0.5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות.
   2. סנן ואחסן את המדיום המלא ב- 4 °C (7°F).
3. הכנת צינורות וכלי ניתוח
   1. לחתוך את האורך המתאים של צינורות עבור לומן קלט, קלט היטב, לומן פלט, ופלט היטב (12 צינורות קצרים 12 צינורות ארוכים). חבר מתאם מתאים לכל צד של הצינור.
   2. הכן את הכלים הכירורגיים: מספריים ישרים, מלקחיים דקים פי 4 ומלקחיים חדים פי 2.
   3. מניחים את הצינורות ואת הכלים הכירורגיים בשקית נייר אוטומטית ומעקרים אותם באמצעות autoclave.
4. הכן את הקלט הזוהר (גירוי רצוי - חיידקים, שרפרף, תרופות וכו ').
   1. לפני הניסוי, לקבוע את העומס החיידקי של תרבית החיידקים, על ידי דילול סדרתי¹², ותרבות בתנאים אירוביים ו / או אנאירוביים.
   2. לאחר חישוב העומס החיידקי, לדלל את תרביות החיידקים במדיום תרבית רקמות סטריליות כדי להשיג את ריכוז החיידקים הנדרש. עבור דגימות צואה, לסנן באמצעות מסננת 100 מיקרומטר.
      הערה: עבור גירוי לאבקטריאלי (תרופות, מטבוליטים, וכו '), לדלל את החומר לריכוז הנדרש באמצעות מדיום תרבית המעיים.

2. הכנת התקנה של ניסוי

1. בתוך החממה של תרבות האיברים, הפעל את יחידת התנור, והגדר אותה ל -37 מעלות צלזיוס.
2. הגדר את המשאבות, כמו גם את מזרקי הקלט והפלט.
3. קלט בינוני של תרבית רקמות
   1. במכסה המנוע הביולוגי או הזרימה למינארי, מלאו את מזרקי קלט היטב במדיום תרבות מלא. הנפח הסופי תלוי במשך הניסוי ובקצב הזרימה; בדרך כלל 1 מ"ל / שעה בתוספת מדיום נוסף לטיהור.
   2. חבר את הצינורות למזרקים באמצעות מתאם מנעול Luer. מניחים את המזרקים המלאים במשאבות המזרק.
   3. טהר את מזרקי הקלט. ודא כי בינוני היטב זורם מכל הצינורות לתוך פסולת.
4. קלט זוהר
   1. מלאו את מזרקי הקלט הזוהרים בטיפול בגירוי (חיידקים, תרופות וכו'). הנפח תלוי במשך הניסוי ובקצב הזרימה (בדרך כלל 30 μL/h בתוספת מדיום נוסף לטיהור).
   2. חבר את הצינורות למזרקים באמצעות מתאם מנעול Luer. מניחים את המזרקים המלאים במשאבות המזרק.
   3. טיהור מזרקי קלט. ודא כי הגירוי לזרום מתוך כל הצינורות לתוך פסולת. היזהר לא לזהם את הגירויים השונים.
5. פלטי
   1. הניחו את המזרקים הריקים במשאבות מזרק היציאה (הגדר מצב משאבה ל'משיכה').
6. כיוונון התקן
   1. הגדר את הווסת השולט בתערובת הגז (95% O₂ + 5% CO 2 ) קצב_זרימהלזרימה עדינה ומינימלית.
   2. תבדוק את המכשיר במכסה המנוע.
   3. לשטוף את המחטים של המכשיר עם IMDM סטרילי לשטוף את המחטים.
   4. הוסף 500 μL של מדיום תרבות סטרילית לתוך כל באר של המכשיר.
7. הכנה לפירוק רקמות
   1. שים את הכלים הכירורגיים הסטריליים בתוך מכסה המנוע למינאר.
   2. מלא מזרק 10 מ"ל עם IMDM סטרילי ולחבר סטרילי (autoclaved) 22 G מחט קהה סוף לשטיפה של המעי הגס.

3. תרביות איברים

1. הקרבת עכברים ותחוש רקמות
   1. בשכונת למינאר, להקריב עכברים בני 12-14 יום על ידי עריפת ראש. מרססים את העכברים ב-70% אתנול ומניחים את העכברים על צלחת פלסטיק.
   2. באמצעות מספריים חדים ומלקחיים, לנתח את העכבר ולהוציא את מערכת העיכול מהבטן לפי הטבעת על ידי חיתוך כל רקמות השומן והחיבור. חותכים את המעי הגס ומניחים אותו על צלחת חדשה.
      הערה: מזער את המגע עם רקמת המעי הגס. אין לגעת בחלק האמצעי של רקמת המעי הגס. החזק את הרקמה בעדינות ורק בשולי הרקמה.
2. שטיפה ושטיפה של המעי הגס
   1. תחת מיקרוסקופ ניתוח, יש לשטוף בעדינות את תוכן המעי הגס עם IMDM סטרילי (לצד הפרוקסימלי) עם מזרק מוכן של 10 מ"ל (שלב 2.7.2). לאחר הסרת הצואה מרקמת המעי, מניחים את המעי הגס בצלחת חדשה 6 היטב מלא 0.5 מ"ל של IMDM סטרילי.
3. חיבור נקודתיים להתקן
   1. קח את הרקמה בזהירות לחבר אותו על מחט 22 G ולעשות עניבה הדוקה עם שני החוטים. בשלב זה, זה הכרחי כדי לשמור על הכיוון הנכון של המעי הגס לזרימת לומן (פרוקסימלי = קלט, דיסטלי = פלט). חזור על שלבים 3.2-3.3 עבור כל 6 הרקמות.
   2. ודא שמנעולי לויר מחט הקלט ריקים מהמדיום. אם לא, תרוקן אותם. הוסף גירויים לסלסל Luer מחט הקלט (כדי למנוע כניסה של בועות אוויר לתוך לומן). חזור על שלב זה עבור כל מעי גס עם הגירוי המתאים.
   3. בדוק כי כל הרקמות מחוברות ומניחים את מכסה הכיסוי על גבי המכשיר.
4. חיבור התקן תרבות האיברים למשאבות
   1. מניחים את המכשיר בתא שמבוקר טמפרטורה מחומם מראש (37 °C (37 °F).
5. חיבור זרימת גז
   1. חבר את מתאם הגז למכסה הכיסוי באמצעות מחט הקלט המתאימה.
   2. חבר את צינורות הקלט והפלט להתקן.
      הערה: חבר את הצד הפרוקסימלי של המעי הגס לאמבטיות הקלט.
6. לטהר את הלומן עם תשומות הגירוי.
   1. להזרים בעדינות גירוי זוהר דרך המעיים ולאמת זרימה בינונית בצינורות היציאה.
   2. לשטוף מדיום חיצוני.
   3. לשטוף את המדיום החיצוני 3 פעמים (להגדיר את המשאבות בקצב של 600 μL / min עבור קלט פלט היטב). כל שטיפה אורכת דקה אחת (החל מרוקן הבאר).
7. תתחילו בניסוי.
   1. התחל את המשאבות בקצבים הבאים:
      קצב זרימה: לומן: קלט- 30 μL / h, פלט- 35 μL / h
      מדיום חיצוני: קלט- 1000 μL/h, פלט- 950 μL/h
      הערה: זמן הניסוי יכול להשתנות בין 30 דקות ל-24 שעות.
8. סוף הניסוי (עד 24 שעות לתרבויות איברי המעי הגס)
   1. נתק את כל הצינורות מהמכשיר.
   2. נתק את הרקמות מן המחטים ולהמשיך לקריאות הרצויות.

תוצאות

מערכת תרבית איברי המעיים שומרת על כדאיות רקמות ex vivo. הערכת הכדאיות של הרקמה נעשתה לאורך כל תקופת התרבות. שברי רקמת המעי הגס דוגרו במערכת תרבית איברי המעיים ותוקנו בעקבות תרבית 2/12/24 h. שלמות שכבת תאי האפיתל במעיים (IEC) אומתה על ידי כתמי אימונופלואורסצנטיות באמצעות נוגדנים E-cadherin ו- ציטוק?...

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטב לתרבויות איברי המעיים ex vivo כי Yissachar ואח ' פיתחו לאחרונה^{(פורסם 9} נתונים שלא פורסמו). מערכת תרבית איברי המעיים תומכת בתרבית מולטיפלקסים של שברי מעיים שלמים תוך שמירה על זרימה זוהרת. הוא מספק שליטה מלאה על הסביבה הפנים-אור-זוהרת (כולל מינון גירוי, זמ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device
18 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a754
22 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a758
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone	DAP	688
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves		AAAD4021
Glass Slide 1 mm Thick	Corning	2947-75X50
Mini Incubator im-10		AAH24315K
MPC 301E Vacuum PUMP		VI-412711
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs	Mcmaster	51525k121
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets	Mcmaster	52525k211
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Dow		Polydimethylsiloxane, PDMS
Tubing	Mcmaster	6516t11
Zortrax M200	Zortrax		Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Materials: z-ultrat	Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Serum Free	Thermo Fisher Scientific	17504044
HEPES Buffer (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630056
Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x)	Thermo Fisher Scientific	12440061
Knock-Out Serum	Thermo Fisher Scientific	10828028
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	A1370701
Non Essential Amino Acid (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140035
Surgical Tools
Large Scissors	Aseltech	11-00-10
Sharp Forceps	F.S.T	11297-10
Silk Braided Surgical Thread	SMI	8010G
Straight Scissors	F.S.T	14091-09
Thin Forceps	F.S.T	11051-10
Organ System
0.1 µm Filter	Life Gene
0.22 µm Filter	Life Gene
5 mL Luer Lock Syringe	B-D	309649
Greenough Stereo Microscope	ZEISS	Stemi 305
Recirculating Precision Air Heater "CUBE"		CUBE-2-LIS
Syringe Pump	new era pump systems inc	nep-ne-1600-em