Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

Özet

Bu makale, ex vivo deneyleri için yeni bir bağırsak organ kültürü sistemi kullanarak konak mikrobiyom etkileşimlerini analiz etmek için benzersiz bir yöntem salamaktadır.

Özet

Bağırsak dokusunun yapısı, konakçı ile bağırsak mikrobiyotası arasındaki yakın ve karşılıklı etkileşimleri kolaylaştırır. Bu çapraz görüşmeler yerel ve sistemik homeostazların sürdürülmesi için çok önemlidir; bağırsak mikrobiyota bileşimindeki (disbiyozis) değişiklikler çok çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir. Konak-mikrobiyota etkileşimlerini inceleme yöntemleri, fizyolojik doku yapısının korunması (in vivo hayvan modelleri kullanırken) ve deney faktörleri üzerindeki kontrol seviyesi (basit in vitro hücre kültürü sistemlerinde olduğu gibi) arasında doğal bir dengeyi kapsar. Bu dengeyi ele almak için, Yissachar ve arkadaşları yakın zamanda bir bağırsak organı kültür sistemi geliştirdiler. Sistem naif bir kolon dokusu yapımını ve hücresel mekanizmaları korur ve ayrıca sıkı deneysel kontrole izin vererek vivoolarak kolayca gerçekleştirilemeyen deneyleri kolaylaştırır. Çeşitli bağırsak bileşenlerinin (epitel, immünolojik ve nöronal elementler gibi) kısa süreli yanıtlarını ışık pertürbasyonlarına (anaerobik veya aerobik mikroplar, farelerden veya insanlardan gelen tüm mikrobiyota örnekleri, ilaçlar ve metabolitler dahil) ayırmak için en uygun olanıdır. Burada, özel yapım bir bağırsak kültürü cihazı kullanarak birden fazla bağırsak parçasının organ kültürü için optimize edilmiş bir protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Luminal pertürbasyonlara konak yanıtları, doku bölümlerinin veya tüm montajlı doku parçalarının immünofluoresans boyanması, floresan yerinde hibridizasyon (FISH) veya zaman atlamalı görüntüleme ile görselleştirilebilir. Bu sistem, yeni nesil sıralama, akış sitometrisi ve çeşitli hücresel ve biyokimyasal tahliller de dahil olmak üzere çok çeşitli okumaları destekler. Genel olarak, bu üç boyutlu organ kültürü sistemi büyük, bozulmamış bağırsak dokularının kültürünü destekler ve yerel bağırsak ortamında konak-mikrobiyota etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü analizi ve görselleştirilmesi için geniş uygulamalara sahiptir.

Giriş

Bağırsak, hücrelerin birbirleriyle ve ışık içeriğiyle (mikrobiyota, gıda vb.) etkileşime girmesini ve iletişim kurmasını sağlayan belirli bir yapıda düzenlenmiş çok çeşitli hücre tipleri (epitel hücreleri, bağışıklık sistemi hücreleri, nöronlar ve daha fazlası) içeren son derece karmaşık bir organdır. ¹. Şu anda, konak-mikrobiyota etkileşimlerini analiz etmek için mevcut olan araştırma araç kutusu in vitro hücre kültürlerini ve in vivo hayvan modellerini içerir². In vivo hayvan modelleri fizyolojik doku konstrüksiyon³ sağlar, ancak zayıf deneysel kontrol ve deney koşullarını manipüle etme yeteneği sınırlıdır. İn vitro kültür sistemleri ise, mikroplarla desteklenebilen birincil hücreleri veya hücre hatlarını kullanın⁴Deney parametreleri üzerinde sıkı kontrol sağlar, ancak hücresel karmaşıklıktan ve doku mimarisinden yoksundur. Modern in vitro tahliller, fare veya insan kaynaklarından elde edilen epitel organoidler 5^,6ve mukozal mikroçevreyi taklit eden örnekler gibi sağlıklı ve patolojik insan dokusu örneklerinin ileri düzeyde kullanılmasına izin verir⁷. Başka bir örnek, bağırsak değişmez^8'infizyolojik durumunu taklit etmek için insan kolonik epitel hücre hattı (Caco2), hücre dışı matris ve mikroakışkan kanalları içeren 'çip üzerindeki bağırsak' tahlildir. Bununla birlikte, in vitro örnekler ne kadar gelişmiş ve yenilikçi olsalar da, normal bir doku mimarisi veya naif hücresel bileşim sağlamaz.

Bunu ele almak için, Yissachar ve arkadaşları son zamanlarda sağlam bağırsak parçalarını koruyan bir ex vivo organ kültürü sistemi geliştirdi⁹ (Şekil 1) ex vivo, hem in vivo hem de in vitro modellerin avantajlarından yararlanıyor. Bu ex vivo gut organ kültürü sistemi, altı kolon dokusunun çok katlı kültürünü destekleyen, sistemin giriş ve çıkışlarını kontrol ederken benzer koşullar altında deneysel girdilerin incelenmesine izin veren özel yapım bir kültür cihazına dayanmaktadır. Son çalışmalar, bu sistemin bireysel bağırsak bakterilerine bağırsak yanıtlarını analiz etmek için değerli olduğunu göstermiştir⁹, tüm insan mikrobiyota örnekleri¹⁰ ve mikrobiyal metabolitler¹¹. Bu sistem, ilk kez, bu erken konak-mikrobiyota etkileşimlerinin konak, mikrobiyal ve çevresel bileşenler üzerinde yüksek düzeyde kontrol ile incelenmesine izin verir. Ayrıca, deney boyunca sistemin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve manipüle etmesine izin verir.

Şekil 1: Bağırsak kültürü cihazının şemaları. Bütün bir bağırsak dokusu parçası, odanın çıkış ve giriş portlarına (üstte), lümenin içindeki ve dış orta odanın içindeki orta akışı düzenleyen pompalarla tutturulur. Tüm cihaz (altta) bu tür 6 odacık içerir. Bu rakam Yissachar ve ark. 2017'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Bu protokol, hayvan refahı etik komitesi tarafından onaylanan hayvan bakım yönergelerini izler.

1. Deney hazırlığı

1. Bağırsak organ kültürü cihazının imalatı (3 gün)
   1. 3D yazıcı kullanarak, organ kültürü cihazı için yeniden kullanılabilir plastik kalıpları yazdırın (cihazda 24 küçük ve büyük delikli 6 kuyu ve cihaz kapağı kapağı vardır) (3D dosyalar eklenmiştir).
      NOT: Bu plastik kalıplar çok sayıda cihazın imalatı için kullanılabilir.
   2. Künt uçlu iğneleri (22 G & 18 G) cihaz kalıbı içinde uygun konuma getirin ve cihazın ve kapağın bir seti için yaklaşık 20 g polidimetilsiloksan (PDMS) karışımı (1:10 ağırlık oranı, tabandan katalizöre) dökün.
   3. Hava kabarcıklarını PDMS karışımından çıkarmak için kalıpları 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin.
   4. PDMS polimerizasyonunu tamamlamak için kalıpları bir gecede 55 °C'de kuluçkaya yatırın.
   5. PDMS ayarlandığında, iğneleri kalıptan çıkarın ve kültür cihazını ve kapağı plastik kalıplardan dikkatlice serbest bırakın.
   6. Pdms kalıntılarını bir cerrahi bıçak kullanarak kuyu anahattından çıkarın. PDMS cihazını ve cihaz kapağını toksik olmayan silikon yapıştırıcı kullanarak bir kapak camına (75 mm x 50 mm mikro slaytlar) takın ve parçaları gece boyunca ayarlamak üzere bırakın (yapıştırıcıyı cihazın pürüzsüz tarafına uygulayın).
   7. Lümen için on iki 22 G iğne ve kuyu için on iki 18 G iğne yerleştirin. Silikon kullanarak tüm iğneleri yerinde sabitle ve gece boyunca ayarlasın. Bağırsak organ kültürü cihazına uygun hava akışı için kapak kapağına iki adet 18 G iğne yerleştirin.
   8. Su dolu bir şırınga kullanarak tüm iğneleri sızıntılara karşı kontrol edin. Kuyuları su ile doldurarak kuyulardan sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
   9. Kolona bağlanacak her 22 G iğneye iki cerrahi düğüm yerleştirin. Cihazı ve kapağı bir otoklav kese kağıdına yerleştirin ve bir otoklavda sterilize edin.
2. Kültür ortamı (0,5 saat)
   1. Biyolojik bir kaputun içinde, aşağıdakileri karıştırın (50 mL tüpte): 37 mL Iscove Modifiye Dulbecco'nun Ortası (IMDM), 10 mL KSR serum replasmanı, 1 mL B27 takviyesi, 0,5 mL N2 takviyesi, 0,5 mL 1 M HEPES tamponu ve 0,5 mL esansiyel olmayan amino asitler.
   2. Tüm ortamı filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
3. Boru ve cerrahi takım hazırlama
   1. Giriş lümen, giriş kuyusu, çıkış lümen ve çıkış kuyusu (12 kısa tüp ve 12 uzun tüp) için uygun boru uzunluğunu kesin. Tüpün her iki tarafına uygun bir adaptör bağlayın.
   2. Cerrahi aletleri hazırlayın: düz makas, 4x ince kanat ve 2x keskin eleps.
   3. Tüpleri ve cerrahi aletleri bir otoklav kağıt torbasına yerleştirin ve bir otoklav kullanarak sterilize edin.
4. Işıltı girişini hazırlayın (istenen stimülasyon - bakteri, dışkı, ilaçlar vb.).
   1. Deneyden önce, bakteri kültürünün bakteri yükünü, seri seyreltmeler¹²ve aerobik ve / veya anaerobik koşullar altında kültürü belirleyin.
   2. Bakteri yükünü hesapladıktan sonra, gerekli bakteri konsantrasyonu elde etmek için steril doku kültürü ortamında bakteri kültürlerini seyreltin. Dışkı örnekleri için 100 μm süzgeç kullanarak filtreleyin.
      NOT: Nonbakteriyel stimülasyon (ilaçlar, metabolitler vb.) için, bağırsak kültürü ortamını kullanarak maddeyi gerekli konsantrasyona seyreltin.

2. Deneme kurulum hazırlığı

1. Organ kültürü inkübatörünün içinde, ısıtıcı ünitesini açın ve 37 ° C'ye ayarlayın.
2. Pompaların yanı sıra giriş ve çıkış şırınnalarını da kurun.
3. Doku kültürü ortam girişi
   1. Biyolojik veya laminer akış davlumbazında, giriş kuyusu şırınnalarını tam kültür ortamı ile doldurun. Son hacim deneyin süresine ve akış hızına bağlıdır; genellikle 1 mL/h artı temizleme için ek ortam.
   2. Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırınna bağlayın. Dolu şırınnaları şırınna pompalarına yerleştirin.
   3. Giriş şırınnalarını temizle. Kuyu ortamının tüm tüplerden atık bir cama aktığından emin olun.
4. Işıltılı giriş
   1. Işınlama giriş şırınglarını stimülasyon tedavisi (bakteri, ilaç vb.) ile doldurun. Hacim, denemenin süresine ve akış hızına bağlıdır (genellikle 30 μL / s artı temizleme için ek ortam).
   2. Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırınna bağlayın. Dolu şırınnaları şırınna pompalarına yerleştirin.
   3. Giriş şırınmalarını temizle. Stimülasyonun tüm tüplerden atık bir bardağa aktığından emin olun. Farklı stimülasyonları kirletmemeye dikkat edin.
5. Çıkış
   1. Boş şırıngları çıkış şırıngır pompalarına yerleştirin (pompa modunu 'çekilme' olarak ayarlayın).
6. Cihaz kurulumu
   1. Gaz karışımını (%95 O 2 +_%5 CO₂₎kontrol eden regülatörü hafif ve minimum bir akış için ayarlayın.
   2. Cihazı laminar kaputta inceleyin.
   3. İğneleri yıkamak için cihazın iğnelerini steril IMDM ile yıkayın.
   4. Cihazın her kuyusuna 500 μL steril kültür ortamı ekleyin.
7. Doku diseksiyonu için hazırlık
   1. Steril cerrahi aletleri laminar kaputun içine koyun.
   2. 10 mL'lik bir şırıngayı steril IMDM ile doldurun ve kolonun yıkanması için steril (otomatik kapatılmış) 22 G künt uçlu bir iğne bağlayın.

3. Organ kültürleri

1. Farelerin kurban ve doku diseksiyonu
   1. Laminar bir başlıkta, 12-14 günlük fareleri kafa keserek kurban edin. Fareleri% 70 etanol ile püskürtün ve fareleri plastik bir tabağa yerleştirin.
   2. Keskin makas ve tokmaklar kullanarak fareyi parçalara ayırın ve tüm yağ ve bağ dokularını keserek sindirim sistemini mideden anüse kadar çıkarın. Kolonu kesin ve yeni bir tabağa yerleştirin.
      NOT: Kolon dokusu ile teması en aza indirin. Kolon dokusunun orta kısmına dokunmayın. Dokuyu nazikçe ve sadece dokunun kenarlarında tutun.
2. Kolon yıkama ve yıkama
   1. Diseksiyon mikroskobu altında, kolon içeriğini steril IMDM (proksimal tarafa) ile hazırlanan 10 mL şırıngayla (adım 2.7.2) hafifçe yıkayın. Dışkıyı bağırsak dokusundan çıkardıktan sonra, kolonu 0,5 mL steril IMDM ile dolu yeni bir 6 kuyu plakasına yerleştirin.
3. İki nokta üst üste aygıtı bağlama
   1. Dokuyu alın ve 22 G iğneye dikkatlice bağlayın ve iki iplikle sıkı bir bağ yapın. Bu noktada, kolonun lümen akışına doğru yönelimini korumak zorunludur (proksimal = giriş, distal = çıkış). 6 doku için de 3.2-3.3 adımlarını tekrarlayın.
   2. Giriş iğnesi Luer kilitlerinin ortamdan boş olduğunu doğrulayın. Değilse, boşaltın. Giriş iğnesi Luer kilidine stimülasyonlar ekleyin (hava kabarcıklarının lümene girmesini önlemek için). Uygun uyarılma ile her iki nokta üst üste için bu adımı tekrarlayın.
   3. Tüm dokuların bağlı olup olmadığını kontrol edin ve kapak kapağını cihazın üzerine yerleştirin.
4. Organ kültürü cihazının pompalara bağlanması
   1. Cihazı önceden ısıtılmış sıcaklık kontrollü odaya (37 °C) yerleştirin.
5. Gaz akışını bağlayın
   1. Uygun giriş iğnesini kullanarak gaz adaptörünü kapak kapağına bağlayın.
   2. Giriş ve çıkış tüplerini cihaza bağlayın.
      NOT: Proksimal kolon tarafını giriş küvetlerine bağlayın.
6. Lümeni stimülasyon girişleriyle arındırın.
   1. Işıklı stimülasyonu bağırsaktan hafifçe geçirin ve çıkış tüplerindeki orta akışı doğrulayın.
   2. Harici ortamı yıkayın.
   3. Harici ortamı 3 kez yıkayın (pompaları hem giriş hem de çıkış için 600 μL/ dk hızında ayarlayın). Her yıkama 1 dakika sürer (kuyuyu boşaltarak başlar).
7. Deneye başlayın.
   1. Pompaları aşağıdaki oranlarda başlatın:
      Akış hızı: lümen: giriş- 30 μL/h, çıkış- 35 μL/h
      Harici ortam: giriş- 1000 μL/h, çıkış- 950 μL/h
      NOT: Deneme süresi 30 dakika ile 24 saat arasında değişebilir.
8. Deney sonu (kolon organ kültürleri için 24 saate kadar)
   1. Tüm tüpleri cihazdan çıkarın.
   2. Dokuları iğnelerden ayırın ve istenen okumalara devam edin.

Sonuçlar

Bağırsak organ kültürü sistemi doku canlılığını korur ex vivo. Doku canlılığının değerlendirilmesi kültür dönemi boyunca yapıldı. Kolon dokusu parçaları bağırsak organ kültürü sisteminde inkübe edildi ve 2/12/24 saat kültürü takiben sabitlendi. Bağırsak epitel hücre (IEC) tabaka bütünlüğü E-cadherin ve sitokeratin-18 antikorları kullanılarak immünofluoresans lekelenmesi ile doğrulandı. Aynı şekilde, ki-67 boyama ile belirtildiği gibi, kolonik epiteldeki mukus dolu...

Tartışmalar

Bu makalede, Yissachar ve arkadaşlarının yakın zamanda geliştirdiği ex vivo gut organ kültürleri için optimize edilmiş bir protokol açıklanmaktadır^{(yayınlanan 9} ve yayınlanmamış veriler). Bağırsak organ kültürü sistemi, parlak akışı korurken sağlam bağırsak parçalarının çok yönlü kültürünü destekler. İl içi ve ekstra-luminal ortam (stimülasyon dozu, maruz kalma süresi ve akış hızı dahil) üzerinde tam kontrol sağlar ve naif bağırsak dokusu ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device
18 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a754
22 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a758
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone	DAP	688
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves		AAAD4021
Glass Slide 1 mm Thick	Corning	2947-75X50
Mini Incubator im-10		AAH24315K
MPC 301E Vacuum PUMP		VI-412711
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs	Mcmaster	51525k121
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets	Mcmaster	52525k211
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Dow		Polydimethylsiloxane, PDMS
Tubing	Mcmaster	6516t11
Zortrax M200	Zortrax		Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Materials: z-ultrat	Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Serum Free	Thermo Fisher Scientific	17504044
HEPES Buffer (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630056
Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x)	Thermo Fisher Scientific	12440061
Knock-Out Serum	Thermo Fisher Scientific	10828028
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	A1370701
Non Essential Amino Acid (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140035
Surgical Tools
Large Scissors	Aseltech	11-00-10
Sharp Forceps	F.S.T	11297-10
Silk Braided Surgical Thread	SMI	8010G
Straight Scissors	F.S.T	14091-09
Thin Forceps	F.S.T	11051-10
Organ System
0.1 µm Filter	Life Gene
0.22 µm Filter	Life Gene
5 mL Luer Lock Syringe	B-D	309649
Greenough Stereo Microscope	ZEISS	Stemi 305
Recirculating Precision Air Heater "CUBE"		CUBE-2-LIS
Syringe Pump	new era pump systems inc	nep-ne-1600-em