宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

要約

本稿では、新しい腸器官培養システムを用いて、 生体 実験を行うホストとマイクロバイオームの相互作用を分析する独自の方法を紹介する。

要約

腸組織の構造は、宿主と腸内微生物叢との間の密接かつ相互的な相互作用を促進する。これらのクロストークは、局所的および全身的な恒常性を維持するために重要です。腸内微生物叢組成(ジスビオシス)の変化は、幅広いヒト疾患に関連する。宿主-微生物叢相互作用を解剖する方法には、生理学的組織構造の保存( 生体内 動物モデルを使用する場合)と実験因子の制御レベル(単純な インビトロ 細胞培養システム)の間の固有のトレードオフが含まれます。このトレードオフに対処するために、Yissacharらは最近、腸管臓器培養システムを開発した。このシステムは、素朴な結腸組織構造および細胞機構を維持し、また、緊密な実験的制御を可能にし、 生体内で容易に行うことができない実験を促進する。これは、様々な腸成分(上皮、免疫、神経要素など)の発光摂動(嫌気性または好気性微生物、マウスまたはヒト、薬物および代謝産物からの全微生物叢サンプルを含む)の短期的な応答を解剖するのに最適です。ここでは、カスタムメイドの腸培養装置を用いて、複数の腸管断片の器官培養に最適化されたプロトコルの詳細な説明を提示する。発光摂動に対する宿主応答は、組織切片または全実装組織断片の免疫蛍光染色、蛍光インザビトゥーハイブリダイゼーション(FISH)、またはタイムラプスイメージングによって可視化することができる。次世代シーケンシング、フローサイトメトリー、各種細胞・生化学的アッセイなど、幅広い読み出しをサポートします。全体として、この3次元の器官培養システムは、大規模で無傷の腸組織の培養をサポートし、局所的な腸内環境における宿主微生物叢相互作用の高解像度分析および視覚化のための広範な用途を有する。

概要

腸は、細胞が相互に相互作用し、相互に通信することを可能にする特定の構造で組織された細胞タイプ(上皮細胞、免疫系細胞、ニューロンなど)の広い範囲を含む非常に複雑な器官であり、発光含有量(微生物叢、食物など)^1.現在、宿主-微生物叢相互作用を分析するために利用可能な研究ツールボックスには、生体外細胞培養と生体内動物モデル²が含まれる。生体内動物モデルは生理的組織構造³を提供するが、実験制御が不十分であり、実験条件を操作する能力が限られている。一方、インビトロ培養システムは、微生物⁴を補うことができる一次細胞または細胞株を使用し、実験パラメータを厳密に制御するが、細胞の複雑さと組織アーキテクチャを欠いている。現代のin vitroアッセイは、マウスまたはヒト源^由来の上皮オルガノイドのような健康で病理学的なヒト組織サンプルの高度な使用を可能にする^。もう一つの例は、ヒト大腸上皮細胞株(Caco2)、細胞外マトリックスおよび微小流体チャネルを含む「チップ上の腸」アッ^{セイであり、}腸不変8の生理学的状態を模倣する。しかし、in vitroサンプルのように高度かつ革新的であるように、それらは正常な組織アーキテクチャまたはナイーブな細胞組成を維持しない。

その問題に対処するために、Yissacharらの開発は、インビボモデルとインビトロモデルの両方の利点から恩恵を受け、インタクトな腸の断片を維持するex vivo器官培養システム⁹⁽図1)を最近開発した。 このex vivo腸臓器培養システムは、6つの大腸組織の多重化培養をサポートするカスタムメイドの培養装置に基づいており、システムの入力と出力を制御しながら、同等の条件下で実験的入力を調べることができます。最近の研究では、このシステムが個々の腸内細菌^9、ヒト微生物叢サンプル¹⁰および微生物代謝産物¹¹に対する腸内応答を分析するのに有用であることを実証した。このシステムは、初めて、宿主、微生物および環境成分に対する高いレベルの制御を伴うこれらの初期の宿主微生物叢相互作用の研究を可能にする。さらに、リアルタイムで、実験全体を通してシステムを監視し、操作することができます。

図1: 腸管培養装置の概略図 腸組織全体の断片は、チャンバー(上)の出力および入力ポートに取り付けられ、ポンプは内腔内および外部媒体室内の媒体流れを調節する。全体の装置(底部)は6つのそのような部屋を含んでいる。この図は、2017年のYissacharらから変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

このプロトコルは、動物福祉のための倫理委員会によって承認された動物ケアガイドラインに従います。

1. 実験準備

1. 腸臓器培養装置の製造(3日間)
   1. 3Dプリンタを使用して、臓器培養装置(デバイスには6つの井戸があり、24の小さな穴と大きな穴があり、デバイスカバーの蓋)(3Dファイルが添付されています)の再利用可能なプラスチック金型を印刷します。
      注:これらのプラスチック金型は、多数のデバイスの製造に使用することができます。
   2. デバイスモールド内の適切な位置に鈍端の針(22G及び18G)を挿入し、デバイスと蓋の1セットに対して約20gのポリジメチルシロキサン(PDMS)ミックス(1:10重量比、塩基対触媒)を投射します。
   3. 30分間真空チャンバーに金型を入れ、PDMSミックスから気泡を除去します。
   4. 一晩55°Cで金型をインキュベートし、PDMS重合を完了する。
   5. PDMSが設定されたら、金型から針を引き出し、プラスチック金型から培養装置と蓋を慎重に放出します。
   6. 外科用ブレードを使用して、井戸の輪郭からPDMS残基を除去します。PDMSデバイスとデバイスカバーを無毒シリコン接着剤を使用してカバーガラス(75mm x 50 mmマイクロスライド)に取り付け、部品を一晩セットします(デバイスの滑らかな側に接着剤を塗布してください)。
   7. ルーメン用に 22 G 針を 12 本、井戸用に 12 本の 18 G 針を挿入します。シリコーンを使用して所定の位置にすべての針を固定し、一晩に設定してみましょう。2本の18G針を蓋蓋に挿入し、腸内臓器培養装置に出入りする適切な空気の流れを行います。
   8. 水で満たされた注射器を使用して、すべての針の漏れを確認してください。井戸に水を満たして、井戸から漏れがないことを確認します。
   9. 結腸に接続される各22 G針に2つの外科結び目を置きます。デバイスと蓋をオートクレーブの紙袋に入れ、オートクレーブで殺菌します。
2. 培養培地 (0.5時間)
   1. 生物学的フードには、次の(50 mLチューブ)を混合する:イコーブの修飾ダルベッコ培地(IMDM)の37 mL、KSR血清置換の10 mL、B27サプリメントの1 mL、0.5 mLのN2サプリメント、0.5 mLの1 M HEPESバッファー、および0.5 mLの非必須アミノ酸。
   2. フィルター、4 °Cで完全な培地を保存します。
3. チューブおよび外科用ツールの準備
   1. 入力ルーメン、入力ウェル、出力ルーメン、および出力ウェル(12短いチューブと12の長いチューブ)のためのチューブの適切な長さをカットします。チューブの各側面に適切なアダプターを接続します。
   2. 手術用具を準備する:ストレートハサミ、4倍の薄い鉗子、および2x鋭い鉗子。
   3. チューブと手術用具をオートクレーブの紙袋に入れ、オートクレーブを使って滅菌します。
4. 発光入力(所望の刺激 -細菌、便、薬物など)を準備します。
   1. 実験の前に、細菌培養物の細菌負荷を、連続希釈^液12によって決定し、好気性および/または嫌気性条件下で培養する。
   2. 細菌負荷を算出した後、滅菌組織培養液中の細菌培養物を希釈し、必要な細菌濃度を得る。フェカルサンプルの場合は、100 μmのストレーナーを使用してフィルターを使用します。
      注:非細菌刺激(薬物、代謝物など)については、腸内培養培地を用いて必要な濃度まで物質を希釈してください。

2. 実験のセットアップ準備

1. 臓器培養インキュベーターの内部で、ヒーターユニットをオンにし、37°Cに設定します。
2. ポンプだけでなく、入力および出力のスポイツを設定します。
3. 組織培養培地入力
   1. 生物学的または層流フードで、完全な培養培地で入力井戸注射器を充填する。最終的なボリュームは、実験の継続時間と流量によって異なります。通常、1 mL/h に加えて、パージ用の追加の媒体を加えた。
   2. Luerロックアダプターを使用して、チューブを注射器に接続します。充填した注射器をスポイトポンプに入れる。
   3. 入力シリンジをパージします。井戸媒体がすべてのチューブから廃棄物ガラスに流出することを確認してください。
4. ルミナル入力
   1. 発光インプットシリンジに刺激処理(細菌、薬物など)を充填します。ボリュームは、実験の継続時間と流量(通常は30 μL/h+パージ用の追加メディア)によって異なります。
   2. Luerロックアダプターを使用して、チューブを注射器に接続します。充填した注射器をスポイトポンプに入れる。
   3. 入力シリンジをパージします。刺激がすべてのチューブから廃棄物ガラスに流れ出ることを確認してください。異なる刺激を汚染しないように注意してください。
5. 出力
   1. 出力シリンジポンプに空の注射器を入れます(ポンプモードを「離脱」に設定します)。
6. デバイスのセットアップ
   1. 穏やかで最小限の流れのために、ガス混合物(95%O2 + 5%CO2)の流量を制御するレギュレータを設定します。
   2. 薄層フードでデバイスを調べます。
   3. 無菌IMDMで装置の針を洗い流し、針を洗います。
   4. 滅菌培養培地を装置の各ウェルに500μL加えます。
7. 組織解剖の準備
   1. 薄層フードの内側に無菌の外科用具を入れてください。
   2. 滅菌IMDMで10mLの注射器を充填し、結腸のフラッシュのための滅菌(オートクレーブ)22G鈍エンド針を接続します。

3. 臓器文化

1. マウスの犠牲と組織解剖
   1. ラミナルフードで、切断によって12-14日齢のマウスを犠牲にします。70%エタノールでマウスをスプレーし、プラスチックプレートの上にマウスを置きます。
   2. 鋭利なはさみと鉗子を使用して、マウスを解剖し、すべての脂肪と結合組織を切断することによって胃からアヌスに消化管を取り出します。コロンを切り、新しい皿の上に置きます。
      注:結腸組織との接触を最小限に抑えてください。結腸組織の中央部に触れないでください。組織を穏やかに、組織の端にのみ保持します。
2. コロンフラッシュと洗浄
   1. 解剖顕微鏡の下で、調製した10 mLシリンジで滅菌IMDM(近位側)で結腸含有量を静かに洗い流します(ステップ2.7.2)。腸組織から便を取り除いた後、0.5 mLの無菌IMDMで満たされた新しい6ウェルプレートに結腸を入れる。
3. デバイスへのコロンの接続
   1. 組織を取り、慎重に22 G針に接続し、2つの糸でしっかりと結びます。この時点で、ルーメンの流れ(近位=入力、遠位=出力)への結腸の正しい方向を維持することが不可欠です。6つの組織すべてに対して、手順3.2~3.3を繰り返します。
   2. 入力針 Luer ロックがメディアから空であることを確認します。ない場合は、それらを空にします。入力針 Luer ロックに刺激を加えます (ルーメンへの気泡の侵入を避けるため)。適切な刺激を与えたコロンごとにこの手順を繰り返します。
   3. すべてのティッシュが接続されていることを確認し、カバーカバーをデバイスの上に置きます。
4. 臓器培養装置をポンプに接続する
   1. 予熱温度制御チャンバー(37°C)に装置を入れます。
5. 接続ガスの流れ
   1. 適切な入力針を使用して、ガスアダプターをカバーリッドに接続します。
   2. 入力および出力チューブをデバイスに接続します。
      注: 近位コロン側を入力用の浴槽に接続します。
6. 刺激入力でルーメンをパージします。
   1. 腸内に光刺激を穏やかに流し、出力管内の媒体の流れを確認します。
   2. 外付けの媒体を洗浄します。
   3. 外部媒体を3回洗浄します(ポンプは600 μL/minの速度で、入力と出力の両方をうまく行います)。各洗浄は1分かかります(井戸を空にして開始)。
7. 実験を開始します。
   1. 次の速度でポンプを起動します。
      流量:ルーメン:入力- 30 μL/h、出力- 35 μL/h
      外部媒体:入力- 1000 μL/h、出力- 950 μL/h
      メモ:実験時間は30分から24時間の間で変化する可能性があります。
8. 実験終了(大腸臓器培養時は最大24時間)
   1. デバイスからすべてのチューブを取り外します。
   2. 針から組織を取り外し、目的の読み出しに進みます。

結果

腸器官培養システムは、組織生存率 ex vivoを維持する。 組織生存率の評価は培養期間を通じて行った。大腸組織断片を腸内臓器培養系でインキュベートし、2/12/24時間培養後に固定した。腸上皮細胞(IEC)層の完全性をE-カドヘリンおよびサイトケラチン-18抗体を用いた免疫蛍光染色により検証した。同様に、粘液で満たされたゴブレット細胞は、内腔内の大腸上皮および粘液分泌物中で?...

ディスカッション

この記事では、Yissacharらの最近開発した ex vivo 腸器官培養に最適化されたプロトコルについて説明します⁽⁹ および未公開データを公開)。腸器官培養システムは、発光の流れを維持しながら、無傷の腸断片の多重化培養をサポートする。それは、イントラおよび超発光環境(刺激用量、暴露時間および流量を含む)を完全に制御し、ナイーブな腸組織構造とその細胞複雑?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device
18 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a754
22 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a758
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone	DAP	688
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves		AAAD4021
Glass Slide 1 mm Thick	Corning	2947-75X50
Mini Incubator im-10		AAH24315K
MPC 301E Vacuum PUMP		VI-412711
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs	Mcmaster	51525k121
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets	Mcmaster	52525k211
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Dow		Polydimethylsiloxane, PDMS
Tubing	Mcmaster	6516t11
Zortrax M200	Zortrax		Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Materials: z-ultrat	Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Serum Free	Thermo Fisher Scientific	17504044
HEPES Buffer (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630056
Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x)	Thermo Fisher Scientific	12440061
Knock-Out Serum	Thermo Fisher Scientific	10828028
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	A1370701
Non Essential Amino Acid (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140035
Surgical Tools
Large Scissors	Aseltech	11-00-10
Sharp Forceps	F.S.T	11297-10
Silk Braided Surgical Thread	SMI	8010G
Straight Scissors	F.S.T	14091-09
Thin Forceps	F.S.T	11051-10
Organ System
0.1 µm Filter	Life Gene
0.22 µm Filter	Life Gene
5 mL Luer Lock Syringe	B-D	309649
Greenough Stereo Microscope	ZEISS	Stemi 305
Recirculating Precision Air Heater "CUBE"		CUBE-2-LIS
Syringe Pump	new era pump systems inc	nep-ne-1600-em