호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

요약

이 문서는 전 생체 내 실험을 위한 새로운 창자 기관 배양 시스템을 사용하여 호스트-미생물군유전체 상호 작용을 분석하기 위한 독특한 방법을 제시합니다.

초록

창 자 조직의 구조 호스트와 창 자 microbiota 사이 밀접 하 고 상호 상호 상호 작용을 촉진. 이러한 교차 회담은 지역적이고 체계적인 항상성을 유지하는 데 매우 중요합니다. 창자 microbiota 조성에 변경 (dysbiosis) 인간의 질병의 넓은 배열과 연결. 숙주-미생물군유동성 상호작용을 해부하는 방법은 생리조직 구조(생체내 동물 모델에서 사용할 때)와 실험 인자에 대한 제어 수준(간단한 체외 세포 배양 시스템에서와 같이)의 보존 중 내재된 절충을 포함한다. 이 절충을 해결하기 위해 Yissachar 외는 최근에 장 기관 배양 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 순진한 결장 조직 구조 및 세포 메커니즘을 보존하고 또한 엄격한 실험 제어를 허용, 쉽게 생체 내에서수행 할 수없는 실험을 촉진. 발광 성 변류 (혐기성 또는 호기성 미생물, 쥐 또는 인간, 약물 및 대사 산물의 전체 미생물 샘플 포함)에 다양한 창자 구성 요소 (예 : 상피, 면역 학적 및 뉴런 요소)의 단기 반응을 해부하는 것이 최적입니다. 여기에서는 맞춤형 창자 배양 장치를 사용하여 여러 장 조각의 장기 문화에 최적화된 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 발광 성 변투에 대한 숙주 반응은 조직 섹션 또는 전산 조직 단편의 면역 형광 염색, 처투 내 혼성화 (FISH) 또는 시간 경과 이미징에 의해 시각화 될 수 있습니다. 이 시스템은 차세대 시퀀싱, 유동 세포측정, 다양한 세포 및 생화학 적 분석을 포함한 광범위한 판독을 지원합니다. 전반적으로, 이 3차원 기관 배양 시스템은 크고 온전한 장 조직의 배양을 지원하고 현지 창자 환경에서 숙주 미생물 작용의 고해상도 분석 및 시각화를 위한 광범위한 응용을 가지고 있습니다.

서문

소장은 세포가 상호 작용하고 발광 함량 (microbiota, 음식 등)과 상호 작용하고 통신 할 수있는 특정 구조로 조직 된 광범위한 세포 유형 (상피 세포, 면역 계통 세포, 뉴런 등을 포함하는 매우 복잡한 기관)입니다. ¹. 현재, 숙주 -microbiota 상호 작용을 분석할 수 있는 연구 툴박스에는 체외 세포 배양 및 생체 내 동물 모델^2를포함한다. 생체 내 동물 모델은 생리조직 구조^3을 제공하지만 실험 조절이 불량하고 실험 조건을 조작할 수 있는 능력이 제한적이다. 시험관 내 배양 시스템은, 다른 한편으로는, 미생물4로 보충될 수 있는 1차 세포 또는 세포주를 사용하여^실험파라미터를 단단히 통제하지만 세포 복잡성 및 조직 아키텍처가 결여된다. 현대 체외 학적 제는 마우스 또는 인간^소스에서파생 된 상피 오르가노이드와 같은 건강하고 병리학적인 인간 조직 샘플의 고급 사용을^허용5,6,점막 미세 환경을 모방 샘플

프로토콜

이 프로토콜은 동물 복지 윤리위원회가 승인한 동물 관리 지침을 따릅니다.

1. 실험 준비

1. 창자 장기 배양 장치의 제조 (3 일)
   1. 3D 프린터를 사용하여 장기 배양 장치에 재사용 가능한 플라스틱 금형을 인쇄합니다(장치에는 24개의 크고 큰 구멍이 있는 6개의 우물이 있고, 장치 커버 뚜껑의 경우)(3D 파일이 부착됨).
      참고: 이러한 플라스틱 금형은 수많은 장치의 제조에 사용될 수 있습니다.
   2. 무딘 말단 바늘(22 G & 18G)을 장치 몰드 내의 적절한 위치에 삽입하고 1세트의 장치 및 뚜껑에 대해 폴리디메틸실록산(PDMS) 믹스(1:10 중량 비, 베이스 대 촉매)를 약 20g캐스팅한다.
   3. 금형을 진공 챔버에 30분 동안 놓고 PDMS 믹스에서 기포를 제거합니다.
   4. PDMS 중합을 완료하기 위해 하룻밤 동안 55 °C에서 금형을 배양합니다.
   5. PDMS가 설정되면 금형에서 바늘을 꺼내 서 조심스럽게 플라스틱 금형에서 배양 장치 와 뚜껑을 해제합니다.
   6. 수술 용 블레이드를 사용하여 우물 윤곽선에서 PDMS 잔류물을 제거합니다. 비독성 실리콘 접착제를 사용하여 PDMS 장치 와 장치 커버를 커버 유리 (75mm x 50m....

결과

창자 기관 배양 시스템은 조직 생존성 ex vivo를 유지합니다. 조직 생존가능성에 대한 평가는 배양 기간 내내 이루어졌다. 결장 조직 단편은 창자 기관 배양 시스템에서 배양되었고 2/12/24 h 배양 에 따라 고정되었습니다. 장 상피 세포 (IEC) 층 무결성은 E-카데린과 사이토케라틴-18 항체를 사용하여 면역 형광 염색에 의해 검증되었다. 마찬가지로, 루멘 내의 대장 상피 및 점액 분비내의 점액이 .......

토론

이 문서는 Yissachar 등최근 개발 한 ex vivo 창자 장기 문화에 대한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다 (게시^{된 9} 및 게시되지 않은 데이터). 창자 기관 배양 시스템은 발광 흐름을 유지하면서 온전한 장 조각의 멀티플렉스 배양을 지원합니다. 그것은 내- 및 초광도 환경 (자극 복용량, 노출 시간 및 유량을 포함)에 대한 완전한 제어를 제공하고 순진한 장 조직 구조와 세포 복잡?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device
18 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a754
22 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a758
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone	DAP	688
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves		AAAD4021
Glass Slide 1 mm Thick	Corning	2947-75X50
Mini Incubator im-10		AAH24315K
MPC 301E Vacuum PUMP		VI-412711
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs	Mcmaster	51525k121
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets	Mcmaster	52525k211
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Dow		Polydimethylsiloxane, PDMS
Tubing	Mcmaster	6516t11
Zortrax M200	Zortrax		Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Materials: z-ultrat	Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Serum Free	Thermo Fisher Scientific	17504044
HEPES Buffer (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630056
Iscove's Mod Dulbecco's Medium With Phenol Red (1x)	Thermo Fisher Scientific	12440061
Knock-Out Serum	Thermo Fisher Scientific	10828028
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	A1370701
Non Essential Amino Acid (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140035
Surgical Tools
Large Scissors	Aseltech	11-00-10
Sharp Forceps	F.S.T	11297-10
Silk Braided Surgical Thread	SMI	8010G
Straight Scissors	F.S.T	14091-09
Thin Forceps	F.S.T	11051-10
Organ System
0.1 µm Filter	Life Gene
0.22 µm Filter	Life Gene
5 mL Luer Lock Syringe	B-D	309649
Greenough Stereo Microscope	ZEISS	Stemi 305
Recirculating Precision Air Heater "CUBE"		CUBE-2-LIS
Syringe Pump	new era pump systems inc	nep-ne-1600-em