Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

Resumo

Este artigo apresenta um método único para analisar as interações hospedeiro-microbioma usando um novo sistema de cultura de órgãos intestinais para experimentos ex vivo.

Resumo

A estrutura do tecido intestinal facilita interações próximas e mutualísticas entre o hospedeiro e a microbiota intestinal. Essas conversas cruzadas são cruciais para a manutenção da homeostase local e sistêmica; alterações na composição da microbiota intestinal (disbiose) associam-se a uma ampla gama de doenças humanas. Os métodos de dissecar as interações hospedeira-microbiota englobam uma troca inerente entre a preservação da estrutura tecidual fisiológica (ao usar modelos animais in vivo) e o nível de controle sobre os fatores experimentais (como em sistemas simples de cultura celular in vitro). Para lidar com essa troca, Yissachar et al. desenvolveram recentemente um sistema de cultura de órgãos intestinais. O sistema preserva uma construção ingênua de tecido de cólon e mecanismos celulares e também permite um controle experimental rigoroso, facilitando experimentações que não podem ser prontamente realizadas in vivo. É ideal para dissecar respostas de curto prazo de vários componentes intestinais (como elementos epiteliais, imunológicos e neuronais) a perturbações luminais (incluindo micróbios anaeróbicos ou aeróbicos, amostras inteiras de microbiota de camundongos ou humanos, drogas e metabólitos). Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de um protocolo otimizado para a cultura de órgãos de múltiplos fragmentos de intestino usando um dispositivo de cultura intestinal feito sob medida. As respostas do hospedeiro às perturbações luminais podem ser visualizadas pela coloração da imunofluorescência de seções de tecido ou fragmentos de tecido de montagem total, hibridização de fluorescência in-situ (FISH) ou imagens de lapso de tempo. Este sistema suporta uma ampla gama de leituras, incluindo sequenciamento de próxima geração, citometria de fluxo e vários ensaios celulares e bioquímicos. No geral, este sistema tridimensional de cultura de órgãos apoia a cultura de grandes tecidos intestinais intactos e possui amplas aplicações para análise de alta resolução e visualização de interações hospedeira-microbiota no ambiente intestinal local.

Introdução

O intestino é um órgão altamente complexo que contém uma ampla gama de tipos celulares (células epiteliais, células do sistema imunológico, neurônios e muito mais) organizado em uma estrutura particular que permite que as células interajam e se comuniquem entre si e com o conteúdo luminoso (microbiota, alimentos, etc.) ¹. Atualmente, a caixa de ferramentas de pesquisa disponível para análise de interações host-microbiota inclui culturas in vitro células e modelos in vivo animais². Os modelos in vivo animal fornecem uma construção fisiológica de tecido^3, mas com baixo con....

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal aprovadas pelo comitê de ética para o bem-estar animal.

1. Preparação do experimento

1. Fabricação do dispositivo de cultura de órgãos intestinais (3 dias)
   1. Usando uma impressora 3D, imprima os moldes de plástico reutilizáveis para o dispositivo de cultura de órgãos (o dispositivo tem 6 poços, com 24 pequenos e grandes furos, e para a tampa da tampa do dispositivo) (arquivos 3D conectados).
      NOTA: Estes moldes plásticos podem ser usados para fabricação de inúmeros dispositivos.
   2. Insira as agulhas de extremidade bruta (22 G & 18 G) na posição apropriada dentro do ....

Resultados

O sistema de cultura de órgãos intestinais mantém a viabilidade tecidual ex vivo. A avaliação da viabilidade tecidual foi feita durante todo o período cultural. Fragmentos de tecido de cólon foram incubados no sistema de cultura de órgãos intestinais e fixados após a cultura de 2/12/24 h. A integridade da camada da célula epitelial intestinal (IEC) foi validada pela coloração da imunofluorescência usando anticorpos E-cadherin e citokeratin-18. Da mesma forma, foram detectadas células de cálice ch.......

Discussão

Este artigo descreve um protocolo otimizado para culturas de órgãos ex vivo gut que Yissachar et al. desenvolveram recentemente (dados publicados⁹ e inéditos). O sistema de cultura de órgãos intestinais suporta a cultura multiplexada de fragmentos intestinais intactos, mantendo o fluxo luminal. Fornece controle total sobre o ambiente intra e extra-luminal (incluindo dose de estimulação, tempo de exposição e taxa de fluxo) e preserva a estrutura ingênua do tecido intestinal e sua.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device
18 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a754
22 Gauge Blunt Needle	Mcmaster	75165a758
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone	DAP	688
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves		AAAD4021
Glass Slide 1 mm Thick	Corning	2947-75X50
Mini Incubator im-10		AAH24315K
MPC 301E Vacuum PUMP		VI-412711
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs	Mcmaster	51525k121
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets	Mcmaster	52525k211
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Dow		Polydimethylsiloxane, PDMS
Tubing	Mcmaster	6516t11
Zortrax M200	Zortrax		Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Materials: z-ultrat	Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Serum Free	Thermo Fisher Scientific	17504044
HEPES Buffer (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630056
Iscove's Mod Dulbecco's Medium With Phenol Red (1x)	Thermo Fisher Scientific	12440061
Knock-Out Serum	Thermo Fisher Scientific	10828028
N2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	A1370701
Non Essential Amino Acid (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140035
Surgical Tools
Large Scissors	Aseltech	11-00-10
Sharp Forceps	F.S.T	11297-10
Silk Braided Surgical Thread	SMI	8010G
Straight Scissors	F.S.T	14091-09
Thin Forceps	F.S.T	11051-10
Organ System
0.1 µm Filter	Life Gene
0.22 µm Filter	Life Gene
5 mL Luer Lock Syringe	B-D	309649
Greenough Stereo Microscope	ZEISS	Stemi 305
Recirculating Precision Air Heater "CUBE"		CUBE-2-LIS
Syringe Pump	new era pump systems inc	nep-ne-1600-em