A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
בדיקות אוטומטיות באמצעות מיקרו-פלטות מרובות היטב הן גישות מועילות לזיהוי רגולטורים של מסלולים בכך שהן מאפשרות הערכה של מספר רב של תנאים בניסוי אחד. כאן, התאמנו את פרוטוקול ההדמיה והכימות של המקרופינום המבוסס היטב לפורמט מיקרו-לוחית של 96 בארות ומספקים מתאר מקיף לאוטומציה באמצעות קורא לוחות רב-מצבי.
Macropinocytosis הוא מסלול ספיגה לא ספציפי של שלב הנוזלים המאפשר לתאים להפנים מטען חוץ-תאי גדול, כגון חלבונים, פתוגנים ופסולת תאים, באמצעות אנדוציטוזיס בתפזורת. מסלול זה ממלא תפקיד חיוני במגוון תהליכים תאיים, כולל ויסות תגובות חיסוניות וחילוף חומרים של תאים סרטניים. בהתחשב בחשיבות זו בתפקוד הביולוגי, בחינת תנאי תרבית התאים יכולה לספק מידע רב ערך על ידי זיהוי רגולטורים של מסלול זה ואופטימיזציה של תנאים להיות מועסקים בגילוי גישות טיפוליות חדשניות. המחקר מתאר טכניקת הדמיה וניתוח אוטומטית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי וקורא לוחות רב-מצבי הדמיית תאים לכימות המהיר של האינדקס המקרופאינוציטי בתאים דבקים. השיטה האוטומטית מבוססת על ספיגת dextran פלואורסצנטי במשקל מולקולרי גבוה וניתן ליישם אותה על מיקרופלסטיק 96-well כדי להקל על הערכות של תנאים מרובים בניסוי אחד או דגימות קבועות המותקנות על כיסויי זכוכית. גישה זו נועדה למקסם את הרבייה ולהפחית את השונות הניסיונית תוך חיסכון בזמן וחסכוני.
המסלול האנדוציטי הלא ספציפי של מקרופינוציטוזיס מאפשר לתאים להפנים מגוון רכיבים חוץ-תאיים, כולל חומרים מזינים, חלבונים, אנטיגנים ופתוגנים, באמצעות ספיגה בתפזורת של נוזל חוץ-תאי ומרכיביו1. למרות חשוב עבור הביולוגיה של סוגי תאים רבים, יותר ויותר, מסלול macropinocytosis מתואר לשחק תפקיד חיוני בביולוגיה של הגידול, שבו, באמצעות ספיגה macropinocytic, תאים סרטניים מסוגלים לשרוד ולהתרבות בנוכחות microenvironment מזין מדולדל2,3. ספיגת מקרומולקולות חוץ-תאיות, כולל אלבומין ומטריצה חוץ-תאית, ופסולת תאים נמקיים, מספקת מקור מזין חלופי לייצור ביומסה על ידי יצירת חומצות אמינו, סוכרים, שומנים ונוקלאוטידים באמצעות מקרופינוזה ו-lysosome בתיווך קטבוליזם מטען4,5,6,7,8.
האינדוקציה והרגולציה של מקרופינוציטוזה הם מורכבים ויכולים להשתנות בהתאם להקשר התאי. עד כה זוהו מספר ממריצים של מקרופינוציטוזיס וכוללים ליגנדים, כגון גורם גדילה אפידרמלי (EGF), גורם גדילה נגזר טסיות דם (PDGF), גלקטין-3, ו Wnt3A9,10,11,12,13. בנוסף, תנאי פולחן המחקים את microenvironment הגידול יכול לעורר את ההפעלה של המסלול. גידולי אדנוקרצינומה בלבלב (PDAC) סובלים ממחסור בחומרים מזינים, במיוחד עבור חומצת האמינו גלוטמין, הגורמת הן לתאים סרטניים והן לפיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) להסתמך על מקרופינוציטוזה להישרדות7,13,14,15. יתר על כן, לחצי גידול, כגון היפוקסיה ומתח חמצוני, יכול להפעיל את מסלול ניקוי זה16. בנוסף למשפיעים החיצוניים הרבים שיכולים לגרום למקרופאינוציטוזה, מגוון מסלולים תאיים שולטים בהיווצרות מקרופינום. טרנספורמציה אונקוגנית בתיווך ראס מספיקה כדי ליזום את המכונות המקרופינוציטיות, וסוגי סרטן מרובים מציגים מקרופינוציטוזיס מונחה ראס אונקוגני4,5,9,17. לחלופין, סוג פראי הפעלה ראס מסלולים עצמאיים ראס זוהו כדי להפעיל macropinocytosis בתאים סרטניים ו CAFs10,11,15,18. השימוש במודלים שונים של הפריה חוץ גופית בשילוב עם טיפולים מעכבים הביא לזיהוי של מספר אפננים macropinocytosis, הכוללים מחליפי נתרן-מימן, GTPase Rac1 קטן, זרחן phosphoinositide 3-קינאז (PI3K), קינאז מופעל p21 (Pak), וקינאז חלבון מופעל AMP (AMPK)4,13,15 . עם זאת, בהתחשב בשפע של גורמים ותנאים המתוארים המסדירים macropinocytosis, זה מתקבל על הדעת כי הרבה יותר אפננים וגירויים להישאר לא ידוע. זיהוי של אפננים וגירויים חדשניים יכול להיות קל על ידי הערכה אוטומטית של שפע של תנאים בניסוי אחד. מתודולוגיה זו יכולה לשפוך אור על הגורמים המעורבים בהיווצרות מקרופינום ועשויה לאפשר גילוי של מולקולות קטנות או ביולוגיות חדשניות המכוונות למסלול זה.
כאן, התאמנו את הפרוטוקול שלנו שהוקם בעבר לקביעת היקף המקרופאינוציטוזיס בתאי סרטן במבחנה לפורמט מיקרו-פלטה של 96 well והדמיה וכימות אוטומטיים19,20. פרוטוקול זה מבוסס על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, שהפכה לסטנדרט בתחום לקביעת מקרופינוציטוזיס במבחנה וב- vivo4,5,6,7,9,10,11,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. ניתן להבחין בין מקרופינומיסומים למסלולים אנדוציטיים אחרים באמצעות יכולתם להפנים מקרומולקולות גדולות, כגון דקסטרן במשקל מולקולרי גבוה (כלומר, 70 kDa)2,3,4,20,20,21,22,23. לכן, מקרופינוזומים ניתן להגדיר באמצעות ספיגה של פלואורופור מנוהל מחוץ לתאים שכותרתו 70 kDa dextran. כתוצאה מכך, שלפוחיות מקרופינוציטיות מתבטאות כאשכולות תאיים של פונקטה פלואורסצנטית בגדלים הנעים בין 0.2-5 מיקרומטר. אלה puncta ניתן לדמיין מיקרוסקופי ולאחר מכן לכמת כדי לקבוע את מידת macropinocytosis בתא - "אינדקס macropinocytic".
בפרוטוקול זה מתוארים השלבים החיוניים להדמיית מקרופינומיסמים בתאים דביקים במבחנה על לוחית מיקרו-פלטה בת 96 well וכיסויים באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי (איור 1)." בנוסף, ההוראות להפוך את רכישת התמונה לאוטומטית וכימות האינדקס המקרו-פינוציטי באמצעות קורא לוחות מרובה מצבים הדמיה תא מסופקים. אוטומציה זו מפחיתה את הזמן, העלות והמאמץ בהשוואה לפרוטוקולים שתוארו בעבר19,20. בנוסף, הוא נמנע מרכישה וניתוח הדמיה מוטה בשוגג ובכך משפר את יכולת הרבייה והאמינות. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לסוגי תאים שונים או קוראי לוחות או להיות מנוצלת כדי לקבוע תכונות מקרופינום חלופיות, כגון גודל, מספר ומיקום. השיטה המתוארת להלן מתאימה במיוחד לסינון של תנאי תרבית התא הגורמים macropinocytosis, זיהוי של אפננים חדשים, או אופטימיזציה של ריכוזי סמים של מעכבים ידועים.
איור 1: סכמטי של הבדיקה האוטומטית כדי לקבוע את 'האינדקס המקרו-פינוציטי' בתאים דבקים. נוצר באמצעות BioRender. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
1. הכנת חומרים
2. הכנת תאים
3. תיוג מקרופינום
איור 2: הצבת כיסויים על שקופית מיקרוסקופ עם מבודדי סיליקון. (A) מבודדי סיליקון נלחצים ונדבקים לשקופית מיקרוסקופ. (ב) ניתן לאכלס את שקופית המיקרוסקופ כולה ב- 3 מבודדים בסך הכל, וכתוצאה מכך ניתן למרווח זוגי ולוקליזציה הניתנת לשחזור של כתמי הכיסוי. (ג) עבור כל כיסוי, הוסף טיפה של מדיית הרכבה פלואורסצנטית על שקופית המיקרוסקופ בתוך המרחב הפתוח של המבודד. (D) באמצעות מלקחיים, הרימו כיסוי מהצלחת בת 24 הבאר והניחו אותה הפוכה על טיפת המדיה המתעצמת. (ה) כאשר קיימות בועות בין כיסוי הכיסוי לשקופית המיקרוסקופ, הקש בעדינות על כיסוי הכיסוי באמצעות מלקחיים סגורים כדי להסיר בועות. נוצר באמצעות BioRender. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שטיפה של המיקרו-לוחית בת 96 הבאר כדי להתכונן לקיבעון. (א) רוקן את המיקרו-לוחית של המדיה לכוס 5 L על-ידי הבהוב ידני. (B) אנכית ובזווית קלה, הטביעו באיטיות את המיקרו-לוחית בכוס 2 ליטר מלאה ב-PBS קר כקרח. (ג) רוקן את המיקרו-לוחית של PBS לתוך 5 L על-ידי הבהוב ידני. חזור על שלבי הכביסה כמתואר ב - B פעמיים. (D) לאחר ריקון ה- PBS במיקרו-לוחית בפעם האחרונה, הוסף 100 μL 3.7% פורמלדהיד לבארות, באמצעות פיפטה רב ערוצית. נוצר באמצעות BioRender. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
4. הדמיית מקרופינום אוטומטית
תמונות של מקרופינוזומים ניתן ללכוד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי, כפי שתואר בעבר 19,20. עם זאת, הליך כזה ניתן לשפר במונחים של יעילות באמצעות אוטומציה, במיוחד בעת הערכת תנאים רבים שונים של תרבית התא. אוטומציה של רכישת תמונה יכולה להתבצע באמצעות קורא לוחות מרובה מצבים הדמיה תא, אשר מקטין את המאמץ על ידי הפחתת הליכי טיפול, וחשוב מכך, מגביר את רבייה ואמינות נתונים על ידי רכישת תמונות בצורה לא משוחדת. מערכות הדמיה מרובות זמינות מסחרית, והכיוונים יהיו שונים בין מכשירים. כאן, רכישת תמונות באמצעות Cytation 5 מתואר. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול שלהלן לכל מכשיר בודד על ידי דבקות בהנחיות הבאות:
איור 4: מיטוב התנאים לרכישת תמונה. (A) הגדלת ריכוז הגליצרול מגבירה את הפלואורסצנטיות של TMR-dextran, כפי שנקבע בתאי AsPC-1 שטופלו ב-EGF. (ב) קואורדינטות לדוגמה של משואות הדמיה לרכישת תמונה אוטומטית בעת שימוש בלוח 24-well עם תבנית כיסוי. גרף העמודות מציג את הפלואורסצנטיות היחסית הממוצעת עם SEM של 5 ניסויים. מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי ANOVA דו-כיוונית, ביחס ל- PBS. ** עמ' < 0.01; עמ' < 0.001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תנאי בקרה להערכת מקרופינוציטוזה בתאי PDAC. (A) תאי AsPC-1 מציגים מקרופינוציטוזה בתגובה לגירוי EGF של 100 ננוגרם/מ"ל למשך 5 דקות או חסך גלוטמין למשך 24 שעות. לרכישת תמונות, מסגרות תמונה של 4 x 4, 3 x 3, 2 x 3 או 2 x 2 צולמו כדי לקבוע את ההשפעה של מספר התמונות על איכות הנתונים. (B) תאי MIA PaCa-2 מראים מקרופינוציטוזה מכוננת המעכבת על ידי טיפול של 30 דקות עם 75 מיקרומטר EIPA או טיפול 2 שעות עם 10 מיקרומטר EHop-016. מסגרות תמונה צולמו כמו ב - A. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. תרשימי עמודות מציגים את האינדקס המקרופינוציטי היחסי הממוצע עם SD של ניסוי 1 עם 4 שכפולים. המשמעות הסטטיסטית נקבעה על ידי ANOVA דו-כיווני ביחס למצב +Q או רכב. p < 0.001 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
5. קביעת האינדקס המקרו-פינוציטי
'אינדקס macropinocytic' הוא היקף macropinocytosis הסלולר שנקבע על ידי כימות ספיגת dextran פלואורסצנטית לכל תא באמצעות הדמיה מיקרוסקופית19. לשם כך, התמונות שנרכשו משמשות כדי לקבוע את כמות ה- dextran המופנמת על-ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת או האזור החיובי לפלואורסצנטיות ואת המספר הכולל של תאים כפי שנקבעו על-ידי כתמי DAPI. ניתוח זה יכול להתבצע באמצעות תוכנת עיבוד וניתוח תמונה בקוד פתוח, כגון Profiler תא או FIJI / ImageJ, כפי שתואר בעבר 19,20. עם זאת, בעת עבודה עם קורא לוחות מרובה מצבים התוכנה המסופקת עם המכשיר עשויה לכלול יישומי ניתוח מובנים שניתן להשתמש בהם לצורך חישוב האינדקס המקו-פינוציטי. במקרים מסוימים, ייתכן שצבר ניתוח התוכנה המובנה לא יהיה ברור לחלוטין למשתמש. לכן מומלץ לאמת את התוכנה בשלב מוקדם בהשוואה להליך לא אוטומטי, כגון מאבחן תאים או FIJI / ImageJ. ניתן להתאים פרוטוקול זה לכלי תוכנה אחרים לעיבוד וניתוח תמונה על-ידי דבקות בהוראות הכלליות הבאות:
6. הוספת טיפולים
טיפולים בתאים (מולקולות קטנות, ביולוגיה, גורמי גדילה, מטבוליטים וכו ') ניתן לשלב בכל שלב של הפרוטוקול, ואת העיתוי המדויק יהיה תלוי המטרות והמטרות של המחקר.
איור 6: ביצוע עקומת תגובת מינון למעכבי מקרופינוציטוזה. נתונים לדוגמה שהושגו בעת בדיקת מעכבי מקרופינוציטוזה ידועים בקו תא חדש. תאי PATU8998T שימשו לפורמט 96-well microplate וטופלו במשך 2 שעות ו -30 דקות עם הריכוזים המצוינים של (A) EHop-16 ו- (B) EIPA, בהתאמה. השוואת התוצאות שהושגו באמצעות ניתוח תמונה על ידי תוכנת Gen5 או ImageJ אינה מראה הבדלים משמעותיים בין שתי הגישות כפי שצוין על ידי ns in (A). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. תרשימי עמודות מציגים את הממוצע ואת ה- SD של ניסוי יחיד עם 4 עותקים משוכפלים. מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני, בהשוואה לתנאים שלא טופלו. * עמ' < 0.05; עמ' < 0.001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כאשר השלבים וההתאמה של הפרוטוקול המתואר לעיל מתבצעים בהתאם, התוצאות הניסיוניות הסופיות צריכות לספק מידע על אם תנאי תרבית התא הנחקרים או מעכבים לגרום או להפחית macropinocytosis בקו התא של עניין. כדי לחזק את תוקפם של ממצאים אלה, הכללת תנאי הבקרה תאפשר לבחון את התוצאות כדי לקבוע אם הניסוי הושלם בהצל?...
איכות הניסויים ורכישת הנתונים תלויה מאוד באיכות הריאגנטים, באופטימיזציה של ההגדרות ובניקיון כיסויי הכיסוי והמיקרו-לוחית. התוצאות הסופיות צריכות לתת שונות מינימלית בין שכפולים; עם זאת, שינויים ביולוגיים מתרחשים באופן טבעי או עלולים להיגרם בדרך אחרת על ידי מספר גורמים. צפיפות תאים עלולה ל...
C.C. הוא ממציא על פטנט שהונפק שכותרתו ''אבחון סרטן, טיפוליות, וגילוי תרופות הקשורים macropinocytosis,' פטנט מס ': 9,983,194.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH / NCI (R01CA207189, R21CA243701) ל- C.C. KMO.G. הוא מקבל פרס מלגת פוסט-דוקטורט TRDRP (T30FT0952). BioTek Cytation 5 הוא חלק מליבת הדמיית התאים של סנפורד ברנהם פרביס, המקבלת תמיכה כספית ממענק התמיכה של מרכז הסרטן NCI (P30 CA030199). איורים 1-3 נוצרו באמצעות BioRender.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved