הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.

Abstract

אוטופגיה היא תהליך קטבולי מיוחד המפרק באופן סלקטיבי רכיבים ציטופלזמיים, כולל חלבונים ואברונים פגומים. אוטופגיה מאפשרת לתאים להגיב פיזיולוגית לגירויי לחץ, ובכך לשמור על הומאוסטזיס תאי. תאים סרטניים עשויים לווסת את רמות האוטופגיה שלהם כדי להסתגל לתנאים שליליים כגון היפוקסיה, מחסור בחומרים מזינים או נזק שנגרם על ידי כימותרפיה. אדנוקרצינומה של הלבלב היא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר. לתאי סרטן הלבלב יש פעילות אוטופגיה גבוהה עקב הגברת השעתוק וההפעלה שלאחר התרגום של חלבוני אוטופגיה.

כאן, קו התאים PANC-1 שימש כמודל של תאי סרטן אנושיים בלבלב, וקו תאי הלבלב AR42J שימש כמודל פיזיולוגי של תאי יונקים ממוינים מאוד. מחקר זה השתמש באימונופלואורסנציה של שרשרת אור של חלבון הקשור למיקרוטובול 3 (LC3) כאינדיקטור למצב הפעלת אוטופגיה. LC3 הוא חלבון אוטופגיה אשר, בתנאי בסיס, מראה דפוס מפוזר של התפלגות בציטופלסמה (המכונה LC3-I במצב זה). השראת אוטופגיה מעוררת את הצמידות של LC3 לפוספטידיל-אתנולמין על פני השטח של אוטופגוזומים שזה עתה נוצרו ליצירת LC3-II, חלבון הקשור לקרום המסייע בהיווצרות ובהרחבה של אוטופגוזומים. כדי לכמת את מספר המבנים האוטופגיים המסומנים, נעשה שימוש בתוכנת הקוד הפתוח FIJI בעזרת הכלי "3D Objects Counter".

מדידת הרמות האוטופגיות הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתאים סרטניים מאפשרת לנו לחקור את אפנון האוטופגיה בתנאים מגוונים כגון היפוקסיה, טיפול כימותרפי או הפלת חלבונים מסוימים.

Introduction

מקרואוטופגיה (המכונה בדרך כלל אוטופגיה) הוא תהליך קטבולי מיוחד המפרק באופן סלקטיבי רכיבים ציטופלזמיים, כולל חלבונים ואברונים פגומים ^1,2. אוטופגיה מאפשרת לתאים להגיב פיזיולוגית לגירויי לחץ, ובכך לשמור על הומאוסטזיס תאי³. במהלך אוטופגיה נוצרת שלפוחית קרום כפולה: האוטופגוזום. האוטופגוזום מכיל את מולקולות המטען ומניע אותן לליזוזום לפירוק ^1,4.

אוטופגוזומים מעוטרים על ידי שרשרת אור החלבון האוטופגית המשויכת למיקרוטובול 3 (LC3)⁵. כאשר אוטופגיה אינה מושרית, LC3 מפוזר בציטופלסמה ובגרעין בקונפורמציה LC3-I. מצד שני, כאשר אוטופגיה מושרית, LC3 מצומד עם phosphatidylethanolamine בקרום של מבנים אוטופגיים⁶. קונפורמציה LC3 חדשה זו ידועה בשם LC3-II¹. שינוי הקונפורמציה LC3 גורם לשינויים בלוקליזציה התאית שלו ובנדידת האלקטרופורזה של ג'ל דודציל נתרן סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), אשר ניתן לזהות באמצעות טכניקות כגון אימונופלואורסנציה וכתם מערבי ^5,7. בדרך זו, צימוד LC3 הוא אירוע מפתח בתהליך האוטופגי שניתן להשתמש בו כדי למדוד פעילות אוטופגית.

תא acinar הלבלב הוא תא ממוין מאוד, אשר, בתנאים בריאים, יש שיעור נמוך של אוטופגיה. עם זאת, בתנאים פיזיולוגיים שונים או תחת גירוי תרופתי, הם יכולים להפעיל אוטופגיה. לכן, קביעת רמות אוטופגיות בקו תאים זה שימושית לחקר ההשפעות הישירות או העקיפות האפשריות של סוכנים פרמקולוגיים או ביולוגיים שונים על אוטופגיה ^8,9.

אדנוקרצינומה של הלבלב היא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר, בהתחשב באבחנה המאוחרת שלה ובעמידות הגבוהה שלה^{לכימותרפיה 10}. לתאי סרטן הלבלב יש פעילות אוטופגיה גבוהה עקב הגברת השעתוק וההפעלה שלאחר התרגום של חלבונים הקשורים לאוטופגיה¹¹. תאי סרטן הלבלב עשויים להתאים את רמות האוטופגיה שלהם בתגובה לתנאים שליליים כמו היפוקסיה, מחסור בחומרים מזינים או נזק הנגרם על ידי כימותרפיה¹¹. לפיכך, ניתוח רמות האוטופגיה בתאי סרטן הלבלב יכול לעזור להבין כיצד הם מסתגלים לסביבות משתנות ולהעריך את היעילות של טיפולים המווסתים אוטופגיה.

מחקר זה מראה שיטה לביצוע LC3 immunofluorescence בשני מודלים שונים של תאי הלבלב. המודל הראשון, תאי PANC-1, שימש כמודל לאדנוקרצינומה של צינור הלבלב. תאים אלה טופלו בגמציטאבין, חומר כימותרפי שהוכח בעבר כגורם לאוטופגיה, במיוחד בתאי סרטן הלבלב הנושאים את הגן האונקוגני Kirsten rat sarcoma virus (KRAS)^12,13. המודל השני, תאי AR42J, שימש כמודל פיזיולוגי יותר של תאי לבלב אקסוקריניים. תאים אלה התמינו עם dexamethasone כדי להיות דומים יותר לתאי לבלב acinar¹⁴. בתאים אלה, אוטופגיה הושרה פרמקולוגית באמצעות שימוש ב- PP242, שהוא מעכב mTOR^{רב עוצמה 15}. במחקר זה אנו מדגימים את תחולת הפרוטוקול המתואר בשני מודלים שונים של הלבלב ואת יכולתו להבחין בין מצבים של אוטופגיה נמוכה וגבוהה.

Protocol

1. הכנת תאים

1. משרים כיסויים עגולים בקוטר 12 מ"מ באתנול מוחלט, ומניחים אותם במאונך בבארות של צלחת בת 24 בארות.
2. הסר את הכיסוי, ולחשוף את צלחת רב באר לקרינה אולטרה סגולה במשך 15 דקות.
3. מקמו את הכיסויים בצורה אופקית, וכבסו אותם עם מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco.
4. זרע מספר מעבר נמוך של תאי הלבלב. יש להתאים את הסכום לקבלת מפגש של 50%-75% ביום הקיבוע¹⁶.
   הערה: מומלץ לזרוע 2.5 × 10⁴ PANC-1 או 4 × 10⁴ תאי AR42J לכל באר כדי לקבע את התאים לאחר 3 ימים.
5. תרבית את התאים ב-DMEM המכילים 10% נסיוב בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו-חמצני (CO₂).
   הערה: עבור תאי PANC-1, מומלץ לדגור על התאים במשך יומיים בין זריעת התאים לבין השלבים הבאים. לאחר זמן זה, התאים יכולים להיות נגועים, מטופלים, או מקובעים. פרוטוקול זה מדגים את הטיפול בגמציטאבין בתאי PANC-1 שאינם נגועים ואת התמיינות וטיפול PP242 בתאי AR42J שאינם נגועים.

2. טיפול בתאים

1. טיפול בגמציטאבין לתאי PANC-1
   1. הכינו תמיסה של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר גמציטאבין ב-DMEM יומיים לאחר הזריעה. טפל בכל באר עם 2.6 μL של 1 מיקרוגרם / μL תמיסת gemcitabine כדי להשיג דילול סופי של 20 μM.
   2. דוגרים על התאים במשך 24 שעות באינקובטור.
2. התמיינות AR42J וטיפול PP242
   1. הכן תמיסה של 4 מיקרוגרם / מ"ל dexamethasone ב DMEM.
   2. טפל בכל באר עם 4.9 μL של 4 מיקרוגרם / מ"ל dexamethasone פתרון כדי לקבל דילול סופי של 100 ננומטר.
   3. דוגרים על התאים במשך 48 שעות באינקובטור.
   4. הסר את המדיום, ולטפל בכל באר עם 0.5 μL של 1 mM PP242 כדי לקבל דילול סופי של 1 μM.
   5. דוגרים על התאים במשך שעתיים באינקובטור.

3. תיקון וחדירה של התאים

1. הכינו צלחת 24 בארות עם מתנול קר וצלחת 6 בארות עם מלח חוצץ פוספט קר (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH₂PO₄). שמור אותם על קרח.
2. קחו כל כיסוי בפינצטה, שטפו אותו פעמיים ב-PBS ודגרו במשך 6 דקות במתנול.

4. חסימת התאים

1. יש לשטוף כל כיסוי פעמיים ב-PBS, ולדגור במשך שעה אחת בסרום בקר עוברי 10% ב-PBS (תמיסת חסימה).
   הערה: בשלב זה, ייתכן שהפרוטוקול יושהה. את הכיסויים ניתן לאחסן למשך הלילה במקרר בתמיסת החסימה, ולהמשיך את הפרוטוקול למחרת.

5. דגירה על הכיסויים עם הנוגדן הראשוני

1. הכינו תמיסה ביחס 1:1,000 של אנטי-LC3 בתמיסת החסימה, ותחזקו אותה על קרח.
2. הניחו פיסת סרט איטום מעבדה על מכסה רב בארות.
3. יש להניח טיפה אחת (25 μL) לכל כיסוי של תמיסת אנטי-LC3 מעל סרט האיטום.
4. קח כל כיסוי עם פינצטה, ומניחים אותו מעל טיפת הנוגדנים הראשונית, דואג שצד התא יהיה במגע עם התמיסה.
5. הכינו תא לח על ידי הנחת פיסת נייר לחה בקופסת פלסטיק בעלת תחתית שטוחה.
6. מכניסים את הצלחת מרובת הבארות לתא הלחות, מכסים אותה בנייר כסף ודורים לילה במקרר.

6. דגירה על הכיסויים עם הנוגדן המשני

1. מוציאים את הצלחת מרובת הבארות מתא הלחות, ומחזירים את הכיסויים לצלחת מרובת הקידוחים.
2. בצע שלוש שטיפות עם PBS.
3. הכינו תמיסה של אנטי-ארנב עם תווית פלואורסצנטית עם דילול של 1:800 בתמיסת החסימה, ושמרו אותה על קרח מוגן מפני אור.
4. הניחו פיסת סרט איטום על המכסה הרב-באר.
5. יש להניח טיפה (25 μL) לכל כיסוי של תמיסת אנטי-ארנב מעל סרט האיטום.
6. קח כל כיסוי עם פינצטה, ומניחים אותו מעל טיפת הנוגדנים הראשונית, דואג שצד התא יהיה במגע עם התמיסה.
7. דגרו על הצלחת מרובת הבארות בתא הלחות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) המוגנת מפני אור.

7. צביעת התאים עם 4′ ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)

1. מוציאים את הצלחת מרובת הבארות מתא הלחות, ומחזירים את הכיסויים לצלחת מרובת הקידוחים.
2. בצע שלוש שטיפות עם PBS.
3. הכן תמיסה של 300 ננומטר של DAPI ב-PBS (מוגן מפני אור).
4. יש לדגור על כל מכסה עם תמיסת DAPI למשך 10 דקות.
5. בצע שלוש שטיפות עם PBS. שמור על צלחת רב באר מוגן מפני אור.

8. מונטאז'

1. הכינו שתי כוסות עם מים ופיסת נייר.
2. יש להניח טיפה אחת (10 μL) לכל כיסוי של תמיסת פוליוויניל אלכוהול-Bis(trimethylaluminum)-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane adduct (PVA-DABCO) על שקופית.
   הערה: PVA-DABCO מוכן על-ידי שילוב של 0.25 M DABCO, 10% W/V PVA, 20% גליצרול ו-50% Tris HCl (1.5 M, pH 8.8) במים טהורים במיוחד.
3. קחו כל כיסוי בפינצטה, שטפו אותו בכל מים, ייבשו אותה בנייר והניחו אותה מעל טיפת PVA-DABCO (כשהתאים באים במגע עם התמיסה).
4. תן לו להתייבש במשך הלילה, מוגן מפני אור.

9. צפייה במיקרוסקופ קונפוקלי ולכידת תמונה

1. דמיינו את הכיסויים במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך באמצעות מטרה של סביב 63x¹⁷.
2. צלם תמונות מייצגות של התאים המסומנים בתוויות.

10. כימות נקודות LC3

1. גרור ושחרר כל קובץ תמונה המכיל את הערוצים שנלכדו, כגון ".czi", במסך ImageJ (FIJI) כדי להיפתח. לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח וסגור את חלון המסוף .
2. בכרטיסייה תמונה , בחרו ' צבע' >'פיצול ערוצים'.
3. סגור את התמונות המתאימות לערוצים שאינם תמונת LC3.
4. בכרטיסיה תמונה , בחר התאם > איזון צבע
5. הזיזו את המחוון ' מרבי' שמאלה עד לרוויית התמונה כדי להציג באופן חזותי את קווי המתאר של התא.
6. ציירו את קו המתאר של התא בעזרת הכלי בחירה חופשית .
7. לחץ על לאפס כפתור כדי לאפס את התאמת הצבע.
8. בכרטיסיה עריכה , בחר גזור כדי לגזור את הפריט שנבחר.
9. סגור את התמונה מבלי לשמור אותה.
10. בכרטיסיה עריכה , בחר הדבק.
11. בתפריט ' נתח' , בחרו בכלי 3D Objects Counter.
12. הגדר את הסף. בדוגמה המובאת במחקר זה, הסף נקבע על 2,000.
13. הגדר את מסנן הגודל. במחקר זה, הוא מוגדר בין 50 ל 500.
14. ודא שהתיבות אובייקטים וסיכום מסומנות.
15. לחץ על אישור. מספר הנקודות יתואר כאובייקטים שזוהו בסיכום.

איור 1: דיאגרמה סכמטית של פרוטוקול LC3 immunofluorescence. דיאגרמה סכמטית המייצגת את הפרוטוקול הכללי שסופק עבור LC3 immunofluorescence. איור שנוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מבצע immunofluorescence של LC3 בשורות תאי הלבלב כדי לקבוע את רמות autophagy בתנאים שונים. התוצאה של ניסוי זה הייתה קבלת תמונות סלולריות מהערוצים האדומים והכחולים, המתאימים ל-LC3 ול-DAPI. תמונות LC3 מציינות את ההתפלגות התאית של חלבון זה, בעוד DAPI מראה את הלוקליזציה הגרעינית. איור 2A מר...

Discussion

השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת להמחיש את התפלגות LC3 האנדוגנית בתא ולכמת את הרמות האוטופגיות בתנאים שונים. שיטה דומה נוספת המשמשת לניתוח התפלגות LC3 ולקביעת הפעלת אוטופגיה כוללת טרנספקציה LC3 עם תווית פלואורסצנטית (כגון RFP-LC3)¹⁹. RFP-LC3 transfection יש את היתרונות של לא צריך קיבוע (המאפש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	46-013-CM
12 mm round coverslips	HDA	CBR_OBJ_6467
24 Well- Cell Culture Plate	Sorfa	220300
Absolute ethanol	Biopack	2207.10.00
Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	R37119
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 800
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	62248
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902
DMEN	Sartorius	01-052-1A
Fetal Bovine Serum	NATOCOR	Lintc-634
Gemcitabina	Eli Lilly	VL7502
LC3B (D11) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	3868S
Methanol	Anedra	6197
Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film)	Bemis/Curwood	PM-996
Pen-Strep Solution	Sartorius	03-031-1B
PP242	Santa Cruz Biotechnology	SC-301606
Trypsin EDTA	Gibco	11570626