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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’objectif de ce protocole est de déterminer les niveaux autophagiques dans le cancer du pancréas et les cellules acineuses pancréatiques par immunofluorescence CL3 et quantification des points CL3.

Résumé

L’autophagie est un processus catabolique spécialisé qui dégrade sélectivement les composants cytoplasmiques, y compris les protéines et les organites endommagés. L’autophagie permet aux cellules de répondre physiologiquement aux stimuli de stress et, ainsi, de maintenir l’homéostasie cellulaire. Les cellules cancéreuses peuvent moduler leurs niveaux d’autophagie pour s’adapter à des conditions défavorables telles que l’hypoxie, une carence en nutriments ou des dommages causés par la chimiothérapie. L’adénocarcinome pancréatique canalaire est l’un des types de cancer les plus mortels. Les cellules cancéreuses du pancréas ont une activité d’autophagie élevée en raison de la régulation transcriptionnelle à la hausse et de l’activation post-traductionnelle des protéines d’autophagie.

Ici, la lignée cellulaire PANC-1 a été utilisée comme modèle de cellules cancéreuses humaines pancréatiques, et la lignée cellulaire acineuse pancréatique AR42J a été utilisée comme modèle physiologique de cellules de mammifères hautement différenciées. Cette étude a utilisé l’immunofluorescence de la chaîne légère 3 (CL3) de la protéine associée aux microtubules comme indicateur de l’état de l’activation de l’autophagie. LC3 est une protéine d’autophagie qui, dans des conditions basales, présente un schéma diffus de distribution dans le cytoplasme (connu sous le nom de LC3-I dans cette condition). L’induction de l’autophagie déclenche la conjugaison de la CL3 à la phosphatidyléthanolamine à la surface des autophagosomes nouvellement formés pour former la LC3-II, une protéine liée à la membrane qui aide à la formation et à l’expansion des autophagosomes. Pour quantifier le nombre de structures autophagiques étiquetées, le logiciel open source FIJI a été utilisé à l’aide de l’outil « 3D Objects Counter ».

La mesure des niveaux autophagiques à la fois dans les conditions physiologiques et dans les cellules cancéreuses nous permet d’étudier la modulation de l’autophagie dans diverses conditions telles que l’hypoxie, le traitement de chimiothérapie ou l’élimination de certaines protéines.

Introduction

La macroautophagie (communément appelée autophagie) est un processus catabolique spécialisé qui dégrade sélectivement les composants cytoplasmiques, y compris les protéines et les organites endommagés 1,2. L’autophagie permet aux cellules de répondre physiologiquement aux stimuli de stress et, ainsi, de maintenir l’homéostasie cellulaire3. Au cours de l’autophagie, une vésicule à double membrane se forme : l’autophagosome. L’autophagosome contient les molécules de cargaison et les conduit au lysosome pour la dégradation 1,4.

....

Protocole

1. Préparation cellulaire

  1. Trempez des lamelles de couverture rondes de 12 mm dans de l’éthanol absolu et placez-les verticalement dans les puits d’une plaque de 24 puits.
  2. Retirez le couvercle et exposez la plaque multipuits aux rayons ultraviolets pendant 15 min.
  3. Positionnez les lamelles horizontalement et lavez-les avec le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco.
  4. Ensemencer un faible nombre de passages de cellules pancréatiques. Le montant doit être ajusté pour obtenir une confluence de 50% à 75% le jour de la fixation16.
    NOTE: Il est recommandé d’ensemencer 2,5 × 10 4 PANC....

Résultats

Ce protocole effectue une immunofluorescence de CL3 dans des lignées cellulaires pancréatiques pour déterminer les niveaux d’autophagie dans différentes conditions. Le résultat de cette expérience a été l’obtention d’images cellulaires à partir des canaux rouge et bleu, correspondant à la CL3 et au DAPI. Les images CL3 indiquent la distribution cellulaire de cette protéine, tandis que le DAPI montre la localisation nucléaire. La figure 2A montre une image représentative de.......

Discussion

La méthode décrite dans ce protocole permet de visualiser la distribution endogène de la CL3 dans la cellule et de quantifier les niveaux autophagiques dans différentes conditions. Une autre méthode similaire utilisée pour analyser la distribution de la CL3 et déterminer l’activation de l’autophagie implique la transfection de CL3 marquée par fluorescence (telle que RFP-LC3)19. La transfection RFP-LC3 présente l’avantage de ne pas avoir besoin de fixation (ce qui permet d’applique.......

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Université de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), du Conseil national pour la recherche scientifique et la technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; et PUE 22920170100033) et de l’Agence nationale pour la promotion scientifique et technologique (PICT 2019-01664).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)Corning46-013-CM
12 mm round coverslipsHDACBR_OBJ_6467
24 Well- Cell Culture PlateSorfa220300
Absolute ethanolBiopack2207.10.00
Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)InvitrogenR37119
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 800
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)Invitrogen62248
DexamethasoneSigma AldrichD4902
DMENSartorius01-052-1A
Fetal Bovine SerumNATOCOR Lintc-634
GemcitabinaEli LillyVL7502
LC3B (D11) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology3868S
MethanolAnedra6197
Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film)Bemis/CurwoodPM-996
Pen-Strep SolutionSartorius03-031-1B
PP242Santa Cruz BiotechnologySC-301606
Trypsin EDTAGibco11570626

Références

  1. Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
  2. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes.

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Biologienum ro 194

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