LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가

요약

이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.

초록

자가포식은 단백질과 손상된 세포 소기관을 포함한 세포질 성분을 선택적으로 분해하는 특수한 이화 과정입니다. 자가포식은 세포가 스트레스 자극에 생리적으로 반응하여 세포 항상성을 유지하도록 합니다. 암세포는 저산소증, 영양 결핍 또는 화학 요법으로 인한 손상과 같은 불리한 조건에 적응하기 위해 자가포식 수준을 조절할 수 있습니다. 관 췌장 선암종은 가장 치명적인 유형의 암 중 하나입니다. 췌장암 세포는 자가포식 단백질의 전사 상향 조절 및 번역 후 활성화로 인해 높은 자가포식 활성을 가지고 있습니다.

여기서, 췌장 인간 암세포의 모델로 PANC-1 세포주를 사용하였고, 고도로 분화된 포유류 세포의 생리학적 모델로 AR42J 췌장 선엽 세포주를 사용하였다. 이 연구는 자가포식 활성화 상태의 지표로 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3)의 면역형광을 사용했습니다. LC3는 기저 조건에서 세포질의 확산 분포 패턴을 나타내는 자가포식 단백질입니다(이 조건에서는 LC3-I로 알려짐). 자가포식 유도는 새로 형성된 자가포식소체 표면의 포스파티딜에탄올아민에 대한 LC3의 접합을 촉발하여 자가포식소체의 형성 및 확장을 돕는 막 결합 단백질인 LC3-II를 형성합니다. 라벨이 붙은 자가포식 구조의 수를 정량화하기 위해 오픈 소스 소프트웨어 FIJI가 "3D Objects Counter" 도구를 사용하여 활용되었습니다.

생리적 조건과 암세포 모두에서 자가포식 수준을 측정하면 저산소증, 화학 요법 치료 또는 특정 단백질의 녹다운과 같은 다양한 조건에서 자가포식의 조절을 연구할 수 있습니다.

서문

Macroautophagy (일반적으로 autophagy라고 함)는 단백질과 손상된 세포 소기관을 포함한 세포질 구성 요소를 선택적으로 분해하는 특수 이화 과정입니다 ^1,2. 자가포식은 세포가 스트레스 자극에 생리학적으로 반응하여 세포 항상성을 유지하도록 합니다³. autophagy 동안, 이중 막 소포가 형성됩니다 : autophagosome. 자가포식소체는 화물 분자를 포함하고 분해를 위해 리소좀으로 유도합니다 ^1,4.

자가포식소체는 자가포식 단백질 미세소관 관련 단백질 경쇄 3(LC3)⁵에 의해 장식됩니다. 자가포식이 유도되지 않을 때, LC3는 LC3-I 입체형태의 세포질 및 핵에서 확산된다. 한편, 자가포식이 유도되면, LC3은 자가포식 구조⁶의 막에서 포스파티딜에탄올아민과 접합된다. 이 새로운 LC3 형태는 LC3-II¹로 알려져 있습니다. LC3 형태 이동은 세포 국소화 및 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 이동의 변화를 일으키며, 이는 면역형광 및 웨스턴 블롯 ^5,7과 같은 기술로 감지할 수 있습니다. 이러한 방식으로 LC3 접합은 자가포식 활성을 측정하는 데 사용할 수 있는 자가포식 과정의 핵심 이벤트입니다.

췌장 acinar 세포는 건강한 조건에서 자가포식 비율이 낮은 고도로 분화된 세포입니다. 그러나 다른 생리적 조건이나 약리학적 자극 하에서 자가포식을 활성화할 수 있습니다. 그러므로, 이 세포주에서 자가포식 수준의 측정은 자가포식에 대한 다양한 약리학적 또는 생물학적 제제의 잠재적인 직간접적인 효과를 연구하는 데 유용하다^8,9.

유관 췌장 선암종은 진단이 늦고 화학요법 저항성이 높기 때문에 가장 치명적인 유형의 암 중 하나이다¹⁰. 췌장암 세포는 자가포식 관련 단백질의 전사 상향 조절 및 번역 후 활성화로 인해 높은 자가포식 활성을 갖는다¹¹. 췌장암 세포는 저산소증, 영양 결핍 또는 화학 요법으로 인한 손상과 같은 불리한 조건에 반응하여 자가포식 수준을 조정할 수 있습니다¹¹. 따라서 췌장암 세포의 자가포식 수준을 분석하면 다양한 환경에 적응하는 방법을 이해하고 자가포식 조절 치료의 효과를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 연구는 두 개의 별개의 췌장 세포 모델에서 LC3 면역형광을 수행하는 방법을 보여줍니다. 첫 번째 모델인 PANC-1 세포는 췌관 선암의 모델로 사용되었습니다. 이 세포는 이전에 자가포식을 유도하는 것으로 밝혀진 화학요법제인 젬시타빈으로 처리되었으며, 특히 발암성 Kirsten 쥐 육종 바이러스 유전자(KRAS)를 운반하는 췌장암 세포에서 ^12,13. 두 번째 모델인 AR42J 세포는 외분비 췌장 세포의 보다 생리학적 모델로 사용되었습니다. 이 세포들은 덱사메타손으로 분화되어 acinar pancreatic cells¹⁴와 더 유사해졌습니다. 이들 세포에서, 자가포식은 강력한 mTOR 억제제인 PP242의 사용을 통해 약리학적으로 유도되었다¹⁵. 이 연구에서 우리는 두 가지 다른 췌장 모델로 설명된 프로토콜의 적용 가능성과 낮은 자가포식 상태와 높은 자가포식 상태를 구별하는 능력을 보여줍니다.

프로토콜

1. 세포 준비

1. 12mm 원형 커버슬립을 무수 에탄올에 담그고 24웰 플레이트의 웰에 수직으로 놓습니다.
2. 덮개를 제거하고 멀티웰 플레이트를 15분 동안 자외선에 노출시킵니다.
3. 커버슬립을 수평으로 놓고 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)으로 세척합니다.
4. 낮은 통로 수의 췌장 세포를 시드하십시오. 고정 당일 50%-75% 밀도를 얻기 위해 양을 조정해야 합니다¹⁶.
   참고: 3일 후에 세포를 고정하기 위해 웰당 2.5 × 10 4^PANC-1 또는 4 ×^{10 4} AR42J 세포를 시딩하는 것이 좋습니다.
5. 5% 이산화탄소(_CO2)로 가습된 분위기 하에서 37°C의 인큐베이터에서 10% 소 태아 혈청, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에서 세포를 배양합니다.
   참고: PANC-1 세포의 경우 세포 파종과 다음 단계 사이에 2일 동안 세포를 배양하는 것이 좋습니다. 이 시간 후에, 세포는 형질감염, 치료, 또는 고정될 수 있다. 이 프로토콜은 형질주입되지 않은 PANC-1 세포에서의 젬시타빈에 의한 처리 및 비형질주입된 AR42J 세포에 대한 분화 및 PP242 처리를 예시한다.

2. 세포 처리

1. PANC-1 세포에 대한 젬시타빈 치료
   1. 파종 2일 후 DMEM에 1μg/μL 젬시타빈 용액을 준비합니다. 각 웰을 1μg/μL 젬시타빈 용액 2.6μL로 처리하여 20μM의 최종 희석을 달성합니다.
   2. 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
2. AR42J 분화 및 PP242 처리
   1. DMEM에서 4μg/mL 덱사메타손 용액을 준비합니다.
   2. 각 웰을 4.9μL의 4μg/mL 덱사메타손 용액으로 처리하여 100nM의 최종 희석액을 얻습니다.
   3. 인큐베이터에서 48시간 동안 세포를 배양합니다.
   4. 배지를 제거하고, 각 웰을 0.5 μL의 1 mM PP242로 처리하여 1 μM의 최종 희석액을 얻었다.
   5. 인큐베이터에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.

3. 세포 고정 및 투과화

1. 차가운 메탄올로 24-웰 플레이트를 준비하고, 차가운 인산염 완충 식염수(PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)로 6-웰 플레이트를 준비한다. 얼음 위에 유지하십시오.
2. 핀셋으로 각 커버 슬립을 가져 와서 PBS로 두 번 씻고 메탄올에서 6 분 동안 배양합니다.

4. 세포 차단

1. 각 커버슬립을 PBS로 두 번 세척하고 PBS(차단 용액)에서 10% 소 태아 혈청에서 1시간 동안 배양합니다.
   참고: 이 단계에서는 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다. 커버슬립은 차단 용액으로 냉장고에 밤새 보관할 수 있으며 프로토콜은 다음날 계속할 수 있습니다.

5. 1차 항체와 함께 커버슬립을 배양

1. 차단 용액에 anti-LC3의 1:1,000 용액을 준비하고 얼음 위에 유지합니다.
2. 멀티웰 뚜껑 위에 실험실 밀봉 필름을 놓습니다.
3. 밀봉 필름 위에 anti-LC3 용액의 커버슬립당 한 방울(25μL)을 놓습니다.
4. 핀셋으로 각 커버 슬립을 가져 와서 세포 쪽이 용액과 접촉하도록주의하면서 1 차 항체 방울 위에 놓습니다.
5. 바닥이 평평한 플라스틱 상자에 습기가 많은 종이를 넣어 습기가 많은 챔버를 준비합니다.
6. 멀티웰 플레이트를 습도 챔버에 넣고 호일로 덮고 냉장고에서 밤새 배양합니다.

6. 2차 항체와 함께 커버슬립을 배양

1. 습도 챔버에서 멀티웰 플레이트를 제거하고 커버슬립을 멀티웰 플레이트에 다시 놓습니다.
2. PBS로 세 번 세척하십시오.
3. 차단 용액에 1:800으로 희석 된 형광 표지 된 토끼 방지 용액을 준비하고 빛으로부터 보호 된 얼음 위에 유지하십시오.
4. 멀티웰 뚜껑 위에 밀봉 필름 조각을 놓습니다.
5. 밀봉 필름 위에 토끼 방지 용액의 커버슬립당 한 방울(25μL)을 놓습니다.
6. 핀셋으로 각 커버 슬립을 가져 와서 세포 쪽이 용액과 접촉하도록주의하면서 1 차 항체 방울 위에 놓습니다.
7. 멀티웰 플레이트를 빛으로부터 보호되는 실온(RT)에서 2시간 동안 습도 챔버에서 인큐베이션한다.

7. 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 세포 염색

1. 습도 챔버에서 멀티웰 플레이트를 제거하고 커버슬립을 멀티웰 플레이트에 다시 놓습니다.
2. PBS로 세 번 세척하십시오.
3. PBS 중의 DAPI의 300 nM 용액을 준비한다 (빛으로부터 보호됨).
4. 각 커버슬립을 DAPI 용액으로 10분 동안 배양합니다.
5. PBS로 세 번 세척하십시오. 다중 웰 플레이트를 빛으로부터 보호하십시오.

8. 몽타주

1. 물과 종이 한 장으로 두 개의 비커를 준비하십시오.
2. 폴리비닐 알코올-비스(트리메틸알루미늄)-1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄 부가물(PVA-DABCO) 용액의 커버슬립당 한 방울(10μL)을 슬라이드에 놓습니다.
   참고: PVA-DABCO는 초순수에 0.25M DABCO, 10% W/V PVA, 20% 글리세롤 및 50% Tris HCl(1.5M, pH 8.8)을 결합하여 제조됩니다.
3. 핀셋으로 각 커버 슬립을 가져 와서 각 물 비커에서 씻고 종이에서 말리고 PVA-DABCO 드롭 (용액과 접촉하는 셀과 함께) 위에 놓습니다.
4. 빛으로부터 보호하여 밤새 말리십시오.

9. 컨포칼 현미경 보기 및 이미지 캡처

1. 약 63x¹⁷의 대물렌즈를 사용하여 도립 컨포칼 현미경에서 커버슬립을 시각화합니다.
2. 라벨링된 세포의 대표 이미지를 캡처합니다.

10. LC3 도트 정량화

1. ".czi"와 같이 캡처된 채널이 포함된 각 이미지 파일을 ImageJ(FIJI) 화면으로 끌어다 놓아 엽니다. 대화 상자에서 확인을 클릭하고 콘솔 창을 닫습니다.
2. 이미지( Image ) 탭에서 색상(Color) > 분할 채널(Split Channels)을 선택합니다.
3. LC3 이미지 이외의 채널에 해당하는 이미지를 닫습니다.
4. 이미지(Image) 탭에서 컬러 밸런스 조정(Adjust > Color Balance)을 선택합니다
5. 이미지가 포화될 때까지 [최대] 슬라이더를 왼쪽으로 이동하여 셀 윤곽을 시각화합니다.
6. [자유형 선택 도구]를 사용하여 셀 윤곽선을 그립니다.
7. 재설정 버튼을 클릭하여 색상 조정을 재설정합니다.
8. 편집( Edit ) 탭에서 잘라 내기(Cut )를 선택하여 선택한 항목을 잘라냅니다.
9. 이미지를 저장하지 않고 닫습니다.
10. Edit( 편집 ) 탭에서 Paste(붙여넣기)를 선택합니다.
11. 분석 메뉴에서 3D 개체 카운터 도구를 선택합니다.
12. 임계값을 설정합니다. 이 연구에서 제공된 예에서 임계값은 2,000으로 설정됩니다.
13. 크기 필터를 설정합니다. 이 연구에서는 50에서 500 사이로 설정됩니다.
14. Objects(개체) 및 Summary(요약) 상자가 표시되어 있는지 확인합니다.
15. 확인을 클릭합니다. 점의 수는 요약에서 감지된 개체로 설명됩니다.

그림 1: LC3 면역형광 프로토콜의 개략도. LC3 면역형광에 대해 제공된 일반적인 프로토콜을 나타내는 개략도. BioRender.com 로 만든 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

이 프로토콜은 췌장 세포주에서 LC3의 면역형광을 수행하여 다양한 조건에서 자가포식 수준을 결정합니다. 이 실험의 결과는 LC3 및 DAPI에 해당하는 적색 및 청색 채널에서 세포 이미지를 획득하는 것이었습니다. LC3 이미지는 이 단백질의 세포 분포를 나타내는 반면 DAPI는 핵 국소화를 나타냅니다. 도 2A 는 기저 또는 젬시타빈 처리 조건 하에서 PANC-1 세포에서 LC3의 면역형광 ?...

토론

이 프로토콜에 설명된 방법을 사용하면 세포 내 내인성 LC3 분포를 시각화하고 다양한 조건에서 자가포식 수준을 정량화할 수 있습니다. LC3 분포를 분석하고 자가포식 활성화를 결정하는 데 사용되는 또 다른 유사한 방법은 형광 표지된 LC3 형질감염(예: RFP-LC3)^{을 포함합니다19}. RFP-LC3 형질감염은 고정을 필요로 하지 않고(이는 생세포 이미징(²⁰)에서 이 방법을 적?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	46-013-CM
12 mm round coverslips	HDA	CBR_OBJ_6467
24 Well- Cell Culture Plate	Sorfa	220300
Absolute ethanol	Biopack	2207.10.00
Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	R37119
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 800
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	62248
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902
DMEN	Sartorius	01-052-1A
Fetal Bovine Serum	NATOCOR	Lintc-634
Gemcitabina	Eli Lilly	VL7502
LC3B (D11) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	3868S
Methanol	Anedra	6197
Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film)	Bemis/Curwood	PM-996
Pen-Strep Solution	Sartorius	03-031-1B
PP242	Santa Cruz Biotechnology	SC-301606
Trypsin EDTA	Gibco	11570626