הערכת תוצאות הקישוריות של יחידת הקישוריות המוטורית של דיאפרגמה חולדה מודדת כסמנים ביולוגיים כמותיים של ניוון ופיצוי של נוירונים מוטוריים פרניים

Summary

במחקר זה אנו מציגים שיטת in vivo להערכת מספר היחידה המוטורית וגודלה כדי לכמת את קישוריות היחידה המוטורית של דיאפרגמה חולדה. מתוארת גישה שלב אחר שלב לטכניקות אלה.

Abstract

אובדן תפקוד שרירי ההנשמה הוא תוצאה של פגיעה בנוירונים מוטוריים וניוון עצבי (למשל, פגיעה בעמוד השדרה הצווארי וטרשת אמיוטרופית צידית, בהתאמה). נוירונים מוטוריים פרניים הם החוליה המקשרת הסופית בין מערכת העצבים המרכזית לשריר, והיחידות המוטוריות שלהם בהתאמה (קבוצות של סיבי שריר המעצבבים על ידי נוירון מוטורי יחיד) מייצגות את היחידה התפקודית הקטנה ביותר של מערכת האוורור העצבית-שרירית. פוטנציאל פעולת שרירים מורכבים (CMAP), פוטנציאל יחידה מוטורית יחידה (SMUP) והערכת מספר יחידה מוטורית (MUNE) הן גישות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות המאפשרות הערכה אורכית של שלמות היחידה המוטורית במודלים של בעלי חיים לאורך זמן, אך יושמו בעיקר על שרירי הגפיים. לכן, מטרות מחקר זה הן לתאר גישה במחקרי מכרסמים פרה-קליניים שניתן להשתמש בה לאורך זמן כדי לכמת את MUNE הפרני, גודל היחידה המוטורית (המיוצגת כ-SMUP) ו-CMAP, ולאחר מכן להדגים את התועלת של גישות אלה במודל אובדן נוירונים מוטוריים. סמנים ביולוגיים רגישים, אובייקטיביים ורלוונטיים מבחינה תרגומית לפגיעה עצבית, ניוון והתחדשות בפגיעות ומחלות של נוירונים מוטוריים יכולים לסייע באופן משמעותי ולהאיץ תגליות מחקריות ניסיוניות לבדיקות קליניות.

Introduction

נוירונים מוטוריים פרניים (MNs), המשתרעים מרמות C3 עד C6 מיוטומיים, יוצרים את הקישור הסופי ממערכת העצבים המרכזית (CNS) לשריר הסרעפת¹. יחידות מוטוריות פרניות (MUs) מורכבות מ- MN יחיד בעמוד השדרה וסיבי שריר הסרעפת העצביים שלו יוצרים את היחידה התפקודית הקטנה ביותר של המערכת העצבית-שרירית הנשימתית. תפקוד האוורור דורש כיווץ נאות של שריר הסרעפת המושג באמצעות הפעלה מתואמת של בריכת MU פרנית ^2,3. מחלות נוירולוגיות רבות, כולל טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), גורמות לפגיעה חמורה בהנשמה, ובסופו של דבר תורמות לסיבת המוות⁴.

ניתן להשתמש במספר גישות אלקטרופיזיולוגיות כדי להעריך ולנטר את שלמות מאגר היחידה המוטורית (MU) in vivo. פוטנציאל פעולת שריר מורכב (CMAP) משקף את הדפולריזציה המסוכמת של כל סיבי השריר בשריר מסוים או בקבוצת שרירים מסוימת לאחר גירוי עצבי היקפי והוא רגיש למגוון מצבים עצביים-שריריים, כולל ALS ^5,6 וניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA)^7,8,9. מגבלה של הערכת CMAP היא שהנבטה בטחונית יכולה להוביל לשמירה על משרעת CMAP ושטח גם בנוכחות אובדן MU¹⁰. כדי להתגבר על מגבלה זו, נעשו שינויים בטכניקת CMAP כדי להעריך הן את מספר היחידה המוטורית והן את גודל¹¹. בנוסף, מחקר in vivo שחקר את ההערכה התפקודית של CMAP בסרעפת על ידי מערכת אלקטרופיזיולוגית הציע כי ייתכן שיהיה אפשרי גם להשתמש בטכניקת ההקלטה CMAP של הסרעפת המתוארת להערכת מספר יחידה מוטורית¹².

טכניקת הערכת מספר היחידה המוטורית המצטברת (MUNE) הוצגה לראשונה בתחילת שנות השבעים על ידי McComas et al. עבור שריר extensor digitorum brevis בבני אדם¹³. גישת MUNE המצטברת הייתה שינוי של טכניקת ההקלטה המסורתית CMAP, שבמהלכה הועבר גירוי הולך וגובר כדי להקליט הפרשים תת-מקסימליים קוונטיים, הכל או אף אחד כמדדים של תגובות יחידה מוטורית יחידה. ההפרשים המסוכמים והממוצעים שימשו לחישוב אומדן לגודל פוטנציאל יחידת מנוע יחידה (SMUP). גודל מחושב זה חולק לאחר מכן למשרעת CMAP כדי להעריך את מספר MUs המעצבבים את השריר הנבדק¹¹. MUNE מדגים רגישות גבוהה באיתור וניטור אובדן יחידות מוטוריות, ומאפשר זיהוי של תפקוד לקוי של היחידה המוטורית לפני שינויים נצפים במדדים כגון משרעת CMAP או שטח^14,15. בחולי ALS, MUNE הוכח כרגיש במיוחד, ומשמש סמן ביולוגי בולט להופעת המחלה, התקדמות ופרוגנוזה^16,17.

התאמות רבות של MUNE פותחו ונעשה בהן שימוש נרחב כדי להעריך את תפקוד MU במצבים כגון ניוון עצבי, פגיעה עצבית ותהליך ההזדקנות הטבעי 18,19,20,21. מאז התיאור הראשוני, התאמות שונות המשתמשות הן בתגובות אלקטרופיזיולוגיות והן במדידות כוח מצטבר (מכני) שימשו הן במחקרים בבני אדם והן במודלים של בעלי חיים²². MUNE מספק הערכה תפקודית לא פולשנית של קישוריות נוירון מוטורי עם השריר. יישום אורכי של MUNE מאפשר הבנה של התקדמות המחלה או הפנוטיפ המושרה והערכת ההשפעות המגינות או המתחדשות של התערבויות טיפוליות, הן במסגרות קליניות והן במסגרות פרה-קליניות. ללא קשר ליעילות של MUNE מודד את יכולת השחזור ואת הרלוונטיות הקלינית של הטכניקה עבור בריכות MU בכל הגוף האנושי, המאמצים התמקדו בעיקר בשרירי הגפיים בשרירי מכרסמים 10,23,24,25.

לכן, מטרות מחקר זה היו לתאר גישה להשגת פוטנציאל פעולה מורכב של שרירים (CMAP), SMUP ומספר יחידה מוטורית פרנית (MUNE) כהערכות in vivo שניתן להשתמש בהן לאורך זמן במחקרי מכרסמים פרה-קליניים כדי לכמת את MUNE, גודל היחידה המוטורית (המיוצגת כ-SMUP) ו-CMAP. יתר על כן, אנו מציגים נתונים מייצגים המדגישים את אובדן מספר MU של הסרעפת בעקבות מתן intrapleural של סוכן ניווני MN פרני, רעלן כולרה B מקטע מצומד לספורין (CTB-SAP).

Protocol

כל הנהלים אושרו ונערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מיזורי. ניסויים בוצעו על חולדות Sprague-Dawley זכרים בוגרים, בגילאי 11 עד 15 שבועות. חולדות אלה שוכנו בזוגות והוחזקו תחת מחזור בהיר-חושך ביחס של 12:12, עם גישה למזון מסחרי סטנדרטי ומים שטופלו ב-HCl זמינים בכל עת.

1. הכנת בעלי חיים והרדמה

1. יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים בעת הטיפול בחולדות.
2. מתן הרדמה אינהלציה עם 3-5% איזופלורן, הבטחת אינדוקציה נכונה. לאחר שהחולדה מורדמת כראוי, הניחו אותה במצב שכיבה ושמרו על ההרדמה עם איזופלורן בשאיפה של 1-3%. בדוק את עומק ההרדמה על ידי הפעלת לחץ עדין על כרית כף הרגל האחורית באמצעות מלקחיים כדי לוודא שאין תגובת נסיגה.
   הערה: בהתבסס על גודלה ומשקלה של החולדה, יש לעקוב אחר עומק ההרדמה ולהתאים את ריכוז האיזופלורן בהתאם.
3. שמור על טמפרטורה של 37 ° C באמצעות לוח התחממות תרמוסטטי כדי למנוע שינויים בטמפרטורה שיכולים להשפיע על משרעת CMAP והשהיה.
4. יש למרוח משחה וטרינרית על בסיס נפט על העיניים למניעת יובש. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי התבוננות בקצב הנשימה ובדיקת תגובות נסיגה בעת הפעלת לחץ על כרית כף הרגל עם מלקחיים.
5. הסר שיער מהשליש התחתון של החזה והצוואר כדי להיחקר באמצעות קוצץ. עקוב אחר נשימת החולדה במהלך כל הניסוי.
   הערה: לאחר רישומי CMAP ו-MUNE והפסקת ההרדמה, אין להשאיר את החולדה ללא השגחה עד שהיא חזרה להכרה מספקת. אין להחזיר את בעל החיים לכלוב הביתי עד להחלמה מלאה.

2. מיקום אלקטרודות והגדרתן

1. הניחו זוג אלקטרודות מחט מונופולריות של 28 G כדי להקליט את CMAP, SMUP ו-MUNE כפי שמתואר באיור 1.
   1. מניחים את אלקטרודת המחט הפעילה (E1) תת עורית מעל הקו הקלאוויקולרי האמצעי נחות מגבול הצלע האחרון, ואת אלקטרודת מחט הייחוס (E2) תת עורית בזווית שבין תהליך הקסיפואיד לסחוס הסטרנוקוסטלי האחרון.
      הערה: אין להחדיר את אלקטרודות המחט לשריר הסרעפת; במקום זאת, הם צריכים להיות ממוקמים באזור תת עורי.
2. לגירוי העצב הפרני ביריעת התרדמה, השתמש בזוג אלקטרודות מחט מונופולר 28 G כקתודה ואנודה לגירוי עצבי והניח תת עורית על הצוואר הצידי בין שרירי הקשקשים הקדמיים והאמצעיים, מופרדים בכ -1 ס"מ. ודא שמיקום המחטים המעוררות הוא ברמה מתחת לחוליות הצוואר הרביעית (C4).
   הערה: הימנע מהחדרת האלקטרודות המעוררות עמוק מדי כדי למנוע פגיעה בעצב הפרני או במבנה אחר. איור 1 מדגים את מיקום האלקטרודות.
3. עבור אלקטרודת הקרקע, הניחו אלקטרודת משטח חד פעמית על הזנב.

3. רכישת נתונים

1. Phrenic CMAP
   1. הקלט תגובות CMAP פרניות על ידי הפעלת פולסים מונופאזיים של גל מרובע קתודי עם משך של 0.1 אלפיות השנייה ועוצמה הנעה בין 60 ל -100 mA כדי לעורר את העצב הפרני.
   2. קבל תגובות CMAP תוך הגדלה הדרגתית של עוצמת הגירוי עד שהמשרעת של התגובה מפסיקה להראות עלייה נוספת. כדי להבטיח גירוי על-מקסימלי, יש להעלות את עוצמת הגירוי לכ-120% מהרמה המשמשת ליצירת תגובה מרבית, ולתעד תגובה נוספת. אם גודל CMAP אינו גדל עוד, שקול תגובה זו כ- CMAP המרבי.
      הערה: מתן גירוי במהלך נשיפה עדיף כדי למזער רעשי פעילות שרירים בו זמנית במהלך הקלטת CMAP.
   3. מדדו ותעדו את המשרעת משיא לשיא של CMAP במיליוולטים (mV) (איור 2).
      הערה: ניתן להעריך את משרעת CMAP מבסיס לשיא ומשיא לשיא. מערכות אלקטרודיאגנוסטיות קליניות הן לעתים קרובות ברירת מחדל להעריך בסיס לשיא אשר מחושב מקו הבסיס האיזואלקטרי לשיא השלילי הראשוני.
2. גודל ממוצע של יחידת מנוע בודדת (SMUP) וחישוב MUNE
   1. חשב את גודל SMUP הממוצע באמצעות טכניקת גירוי מצטבר.
      1. כדי לעורר תגובות מצטברות, יש לתת גירוי תת-מקסימלי עם משך זמן של 0.1 מילישניות בתדר 1 הרץ, ולהגדיל בהדרגה את העוצמה במרווחים של 0.03 mA עד להשגת תגובה מינימלית של הכל או אף אחד. לרכוש את התגובה הראשונית עם עוצמת גירוי הנע בין 2 mA ו 10 mA.
      2. אם התגובה הראשונית אינה מתרחשת בעוצמת גירוי בין 2 mA ל -10 mA, שנה את המיקום של הקתודה המעוררת, או לקרב אותה או להרחיק אותה מהעצב הפרני בצוואר, כדי להקטין או להגדיל את עוצמת הגירוי הדרושה, בהתאמה.
      3. אם התגובה המצטברת הראשונה מושגת בעוצמת גירוי הנעה בין 2 mA ל- 10 mA, שמור את התגובה הראשונה ורכוש מרווחים נוספים עם עוצמות גירוי גבוהות יותר ויותר, תוך התאמה במרווחים של 0.03 mA, כדי להשיג סך של 9 תוספות נוספות העונות על הקריטריונים הבאים בשלב 3.2.2.
         הערה: כל SMUP מכומת על-ידי חיסור כל הפרש קבוע מההפרש הקודם.
   2. בעת מדידת התגובות המצטברות, ודא שכל תוספת עומדת בקריטריונים הבאים:
      1. ודא שהשיא השלילי הראשוני של התגובות המצטברות מיושר באופן זמני עם השיא השלילי של תגובת CMAP המקסימלית.
         הערה: התנועות הקלות שנצפו עקב רעשי רקע ממחזורי נשימה טבועות באופי הניסוי. עם זאת, הנוכחות העקבית של SMUPs במהלך תצפית חיה מאשרת את זהותם עבור CMAP ספציפי זה.
      2. מכיוון שהסרעפת היא שריר דינמי המעורב בנשימה, כל מחזור נשימה עשוי לגרום לתנועה בסיסית. לכן, ודא את היציבות והיעדר השבר בכל תגובה מצטברת על ידי אישור עקביות על פני שלוש תגובות כפולות.
         הערה: כדי להבחין בין פוטנציאלים מעוררי אמפליטודה נמוכה, במיוחד SMUP הראשון, לבין רעשי רקע כתוצאה מפעילות נשימתית, חשוב להישאר ערניים ולהתבונן במשך 3-4 מחזורי נשימה. כמו כן, ודא את יישור הפסגות עם אלה של CMAP לדיוק.
      3. ודא שכל הפרש נפרד וגדול יותר מההפרש הקודם. לכן, להבחין חזותית בין תגובות מצטברות בזמן אמת, התבוננות בהם כפי שהם כיסוי על הפרשים שנרשמו בעבר.
         הערה: ניתן לבצע העתקים מרובים של הגירוי בכל משרעת כדי להבטיח עקביות במרווחים ועמידה בקריטריונים שהוגדרו מראש.
      4. לאחר אימות חזותי של כל תוספת עם הקריטריונים הנ"ל, ודא כי משרעת ההפרש היא לפחות 25 μV. אם התוספת נמוכה מ-25 μV, מחק את המדידה והערך מחדש את התגובה.
      5. לאחר רישום של 10 תגובות מצטברות, ודא שהמשרעת של כל תגובת תוספת אינה גדולה משליש מהמשרעת המשולבת של כל 10 ההפרשים, המייצגת את המשרעת הכוללת של התגובה הסופית. אם קריטריון זה אינו מתקיים, חזור על מדידת 10 התגובות המצטברות.
         הערה: הסף של שליש מבוסס על ההנחה שכל תגובה מצטברת מייצגת הפעלה של יחידה מוטורית אחת. אם המשרעת של תגובה מצטברת כלשהי עולה על שליש מהמשרעת המשולבת של כל עשר ההפרשים, הדבר מצביע על כך שלא ניתן לייחס את התגובה אך ורק להפעלה של יחידה מוטורית יחידה. במקום זאת, זה יכול להיות מושפע על ידי גיוס של יחידות מוטוריות נוספות או נוכחות של פעילות לא ספציפית, כגון רעש חשמלי או חפצים^22,26.
      6. כדי להעריך את המשרעת הממוצעת של SMUPs, ממוצע את הערכים של 10 הפרשים. שיטה נוספת למדידת משרעת SMUP ממוצעת היא לחלק את כל המשרעת של התגובה המצטברת הסופית במספר הכולל של הפרשים¹¹.
   3. קבע MUNE על ידי חלוקת משרעת CMAP המרבית (שיא לשיא) באמפליטודת SMUP ממוצעת (שיא לשיא). במערכות אלקטרופיזיולוגיות מסוימות, SMUPs נרשמים במיקרו-וולטים (μV), בעוד CMAP מבוטא בדרך כלל במיליוולטים (mV). במידת הצורך, המר מדידות CMAP ו- SMUP לאותן יחידות לפני חישוב MUNE.
      הערה: CMAP משיא לשיא, SMUP ממוצע ו- MUNE מחושבים בדרך כלל באופן אוטומטי על-ידי מערכות אלקטרומיוגרפיה במרפאה):
      
      CMAP = פוטנציאל פעולה מורכב של שרירים
      SMUP = פוטנציאל יחידה מוטורית יחידה יחידה
      MUNE = הערכת מספר יחידת מנוע

תוצאות

טכניקות CMAP, SMUP ו-MUNE המתוארות בדו"ח זה מאפשרות רישום של תפקוד עצבי-שרירי בשריר הסרעפת תוך שימוש במיקום אלקטרודות זעיר פולשני (איור 1). ניתן להשתמש בפרמטרים של משרעת ושטח כדי לאפיין את גודל CMAP העל-מקסימלי, ולספק מדד כולל של תפוקת קבוצת השרירים (איו?...

Discussion

במחלות ניווניות של MN, כגון ALS, חיוני להעריך את MUs המעורבים בהנשמה²⁸. למרות התרחשות של ניוון MN נשימתי בחולי ALS, ההתחלה וההתקדמות הספציפיות של מוות MN עדיין לא מובנות לחלוטין 29,30,31. מתוך הכרה בחשיבותו של היבט זה, מו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Glass Syringe	Kent Scientific Corporation	SOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN syringe	Hamilton Company	7637-01	Utilized to conduct intrapleural injection
5008 - Formulab Diet	LabDiet	0001325
Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°)	Hamilton Company	7804-04	Utilized to conduct intrapleural injection
Cholera toxin B-subunit (CTB)	MilliporeSigma	C9903	Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons
Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP)	Advanced Targeting Systems	IT-14	Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death
Detachable Cable	Technomed	202845-0000	to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads	Cadwell	302290-000	ground electrode
disposable monopolar needles 28 G	Technomed	202270-000	cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)	Cadwell	190266-200	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Isoflurane (250 mL bottle)	Piramal Healthcare
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corporation	PS-RT	Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Saporin (SAP)	Advanced Targeting Systems	PR-01	Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself)
Sierra Summit EMG system	Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA		portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SOMNO	Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Sprague-Dawley rat	Envigo colony 208a, Indianapolis, IN
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury