横隔膜運動ニューロンの変性と補償の定量的バイオマーカーとしてのラット横隔膜運動ユニット接続性結果測定の評価

要約

この研究では、ラットのダイヤフラム運動ユニットの接続性を定量化するために、運動ユニットの数とサイズを推定するための in vivo 法を紹介します。これらの手法に対する段階的なアプローチについて説明します。

要約

人工呼吸器筋機能の喪失は、運動ニューロンの損傷と神経変性の結果です(例:.、頸髄損傷と筋萎縮性側索硬化症)。横隔膜運動ニューロンは、中枢神経系と筋肉との間の最終的なリンクであり、それぞれの運動単位(単一の運動ニューロンによって神経支配される筋線維のグループ)は、神経筋換気システムの最小の機能単位を表しています。複合筋活動電位 (CMAP)、単一運動単位電位 (SMUP)、および運動単位数推定 (MUNE) は、動物モデルの運動単位の完全性を経時的に評価できるようにする確立された電気生理学的アプローチですが、主に四肢の筋肉に適用されています。したがって、この研究の目的は、横隔膜 MUNE、運動単位サイズ (SMUP として表される)、および CMAP を定量化するために縦断的に使用できる前臨床げっ歯類研究のアプローチを説明し、運動ニューロン損失モデルでこれらのアプローチの有用性を実証することです。運動ニューロンの損傷や疾患におけるニューロンの損傷、変性、再生に関する高感度で客観的、かつ翻訳的に関連性のあるバイオマーカーは、実験的研究の発見から臨床試験までを大幅に支援し、加速させることができます。

概要

C3からC6筋節レベルまで伸びる横隔膜運動ニューロン(MN)は、中枢神経系(CNS)から横隔膜筋¹への最終的なリンクを形成します。横隔膜運動単位 (MU) は、単一の脊髄 MN とその神経支配された横隔膜筋線維で構成され、呼吸器系の最小の機能単位を形成します。換気機能には、横隔膜MUプール^の協調的な活性化によって達成される横隔膜筋の適切な収縮が必要です^2,3。筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む多くの神経疾患は、重度の換気障害を引き起こし、最終的には死因の一因となります⁴。

いくつかの電気生理学的アプローチを使用して、in vivoでの運動ユニット(MU)プールの完全性を評価および監視できます。複合筋活動電位(CMAP)は、末梢神経刺激後の特定の筋肉または筋肉群のすべての筋線維の合計脱分極を反映しており、ALS ^5,6および脊髄性筋萎縮症(SMA)^7,8,9

プロトコル

すべての手順は、ミズーリ大学の動物管理および使用委員会によって確立されたガイドラインに従って承認および実施されました。実験は、11〜15週齢の成体の雄Sprague-Dawleyラットで行われました。これらのラットはペアで飼育され、12:12の明暗サイクル下に置かれ、標準的な市販のペレット食品とHCl処理水が常に利用可能でした。

1.動物の準備と麻酔の分娩

1. ネズミを取り扱うときは、適切な個人用保護具を着用してください。
2. 吸入麻酔薬に3〜5%イソフルランを投与し、適切な導入を確保します。ラットが適切に麻酔されたら、仰臥位に置き、1〜3%の吸入イソフルランで麻酔を維持します。.鉗子を使用して後肢の足パッドに優しく圧力をかけ、離脱反応がないことを確認して、麻酔の深さの十分性を確認します。
   注:ラットのサイズと体重に基づいて、麻酔の深さを監視し、それに応じてイソフルラン濃度を調整します。
3. サーモスタット加温プレートを使用して温度を37°Cに維持し、CMAPの振幅と遅延に影響を与える可能性のある温度の変動を防ぎます。
4. 乾燥を防ぐために、獣医用石油ベースの軟膏を目に塗ります。呼吸数を観察し、鉗子でフットパッドに圧力をかけたときの離脱反応を確認することにより、麻酔の深さを監視します。
5. ....

ディスカッション

ALSなどのMN変性疾患では、換気に関与するMUを評価することが重要である²⁸。ALS患者における呼吸器性MN変性の発生にもかかわらず、MN死の特異的な発症と進行は未だに完全には理解されていない29,30,31。この側面の重要性を認識して、遺伝的ベース(SOD1 ^2,32

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Glass Syringe	Kent Scientific Corporation	SOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN syringe	Hamilton Company	7637-01	Utilized to conduct intrapleural injection
5008 - Formulab Diet	LabDiet	0001325
Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°)	Hamilton Company	7804-04	Utilized to conduct intrapleural injection
Cholera toxin B-subunit (CTB)	MilliporeSigma	C9903	Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons
Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP)	Advanced Targeting Systems	IT-14	Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death
Detachable Cable	Technomed	202845-0000	to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads	Cadwell	302290-000	ground electrode
disposable monopolar needles 28 G	Technomed	202270-000	cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)	Cadwell	190266-200	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Isoflurane (250 mL bottle)	Piramal Healthcare
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corporation	PS-RT	Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Saporin (SAP)	Advanced Targeting Systems	PR-01	Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself)
Sierra Summit EMG system	Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA		portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SOMNO	Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Sprague-Dawley rat	Envigo colony 208a, Indianapolis, IN
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury