Frenik Motor Nöron Dejenerasyonu ve Kompanzasyonunun Kantitatif Biyobelirteçleri Olarak Sıçan Diyafram Motor Ünitesi Bağlantı Sonuç Ölçütlerinin Değerlendirilmesi

Özet

Bu çalışmada, sıçan diyaframlı motor ünitesi bağlantısını ölçmek için motor ünite sayısını ve boyutunu tahmin etmek için in vivo bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniklere adım adım bir yaklaşım açıklanmaktadır.

Özet

Ventilasyon kas fonksiyonunun kaybı, motor nöron hasarı ve nörodejenerasyonun bir sonucudur (ör., sırasıyla, servikal omurilik yaralanması ve amyotrofik lateral skleroz). Frenik motor nöronlar, merkezi sinir sistemi ile kas arasındaki son bağlantıdır ve ilgili motor birimleri (tek bir motor nöron tarafından innerve edilen kas lifi grupları), nöromüsküler ventilasyon sisteminin en küçük fonksiyonel birimini temsil eder. Bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP), tek motor ünite potansiyeli (SMUP) ve motor ünite sayısı tahmini (MUNE), hayvan modellerinde zaman içinde motor ünite bütünlüğünün uzunlamasına değerlendirilmesini sağlayan yerleşik elektrofizyolojik yaklaşımlardır, ancak çoğunlukla ekstremite kaslarına uygulanmıştır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, preklinik kemirgen çalışmalarında, frenik MUNE, motor ünite boyutu (SMUP olarak temsil edilir) ve CMAP'yi ölçmek için uzunlamasına kullanılabilecek bir yaklaşımı tanımlamak ve daha sonra bu yaklaşımların bir motor nöron kaybı modelinde faydasını göstermektir. Motor nöron hasarı ve hastalıklarında nöronal hasar, dejenerasyon ve rejenerasyon için hassas, objektif ve translasyonel olarak ilgili biyobelirteçler, deneysel araştırma keşiflerine klinik testlere önemli ölçüde yardımcı olabilir ve hızlandırabilir.

Giriş

C3'ten C6 miyotom seviyelerine kadar uzanan frenik motor nöronlar (MN'ler), merkezi sinir sisteminden (MSS) diyafram kasına¹ son bağlantıyı oluşturur. Frenik motor üniteler (MU), solunumsal nöromusküler sistemin en küçük fonksiyonel ünitesini oluşturan tek bir spinal MN ve onun innerve diyafram kas liflerinden oluşur. Ventilasyon fonksiyonu, frenik MU havuzunun koordineli aktivasyonu ile elde edilen diyafram kasının yeterli kasılmasını gerektirir ^2,3. Amyotrofik lateral skleroz (ALS) dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalık, ciddi ventilasyon bozukluğuna neden olur ve sonuçta ölüm nedenine katkıda bulunur⁴.

Motor ünitesi (MU) havuzunun bütünlüğünü in vivo olarak değerlendirmek ve izlemek için çeşitli elektrofizyolojik yaklaşımlar kullanılabilir. Bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP), periferik sinir stimülasyonundan sonra belirli bir kas veya kas grubundaki tüm kas liflerinin toplam depolarizasyonunu yansıtır ve ALS ^5,6 ve spinal müsküler atrofi (SMA) dahil olmak üzere bir dizi nöromüsküler duruma duyarlıdır7,8,9. CMAP değerlendirmesinin bir sınırlaması, teminat filizlenmesinin, MU kaybı¹⁰ varlığında bile CMAP genliğinin ve alanının korunmasına yol açabilmesidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, hem motor ünite numarasını hem de¹¹ boyutunu değerlendirmek için CMAP tekniğinde değişiklikler yapılmıştır. Ek olarak, diyafram CMAP'nin bir elektrofizyolojik sistem tarafından fonksiyonel değerlendirmesini araştıran bir in vivo çalışma, motor ünite numarası tahmini¹² için açıklanan diyafram CMAP kayıt tekniğinin kullanılmasının da mümkün olabileceğini düşündürmektedir.

Artımlı motor birim sayısı tahmini (MUNE) tekniği ilk olarak 1970'lerin başında McComas ve ark. insanlarda ekstansör digitorum brevis kası için¹³. Artımlı MUNE yaklaşımı, tek motor ünite tepkilerinin indeksleri olarak nicel, ya hep ya hiç submaksimal artışları kaydetmek için kademeli olarak artan bir stimülasyonun sağlandığı geleneksel CMAP kayıt tekniğinin bir modifikasyonuydu. Toplanan ve ortalaması alınan artışlar, tek bir motor birim potansiyelinin (SMUP) boyutu için bir tahmin hesaplamak için kullanıldı. Hesaplanan bu boyut daha sonra incelenen kası innerve eden MU'ların sayısını tahmin etmek için CMAP genliğine bölündü¹¹. MUNE, motor ünite kaybını tespit etmede ve izlemede yüksek hassasiyet gösterir ve CMAP genliği veya alan^14,15 gibi ölçümlerde gözlemlenebilir değişikliklerden önce motor ünite disfonksiyonunun tanımlanmasına olanak tanır. ALS hastalarında, MUNE'nin son derece hassas olduğu kanıtlanmıştır ve hastalık başlangıcı, ilerlemesi ve prognozu için önemli bir biyobelirteç olarak hizmet etmektedir ^16,17.

Nörodejenerasyon, nöral yaralanma ve doğal yaşlanma süreci gibi durumlarda MU fonksiyonunu değerlendirmek için çok sayıda MUNE adaptasyonu geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmıştır 18,19,20,21. İlk tanımlamadan bu yana, hem insan çalışmalarında hem de hayvan modellerinde hem elektrofizyolojik tepkileri hem de artımlı kuvvet (mekanik) ölçümlerini kullanan çeşitli uyarlamalar kullanılmıştır²². MUNE, kas ile motor nöron bağlantısının non-invaziv fonksiyonel bir değerlendirmesini sağlar. Uzunlamasına MUNE uygulamak, hem klinik hem de klinik öncesi ortamlarda hastalık veya indüklenmiş fenotip ilerlemesinin anlaşılmasını ve terapötik müdahalelerin koruyucu veya rejeneratif etkilerinin değerlendirilmesini sağlar. MUNE ölçümlerinin etkinliğinden bağımsız olarak, tekrarlanabilirlik ve tekniğin insan vücudunun çoğu boyunca MU havuzları için klinik önemi ne olursa olsun, çabalar büyük ölçüde kemirgen kaslarındaki uzuv kaslarına odaklanmıştır 10,23,24,25.

Bu nedenle, bu çalışmanın amaçları, MUNE, motor ünite boyutu (SMUP olarak temsil edilir) ve CMAP'yi ölçmek için klinik öncesi kemirgen çalışmalarında uzunlamasına kullanılabilecek in vivo değerlendirmeler olarak bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP), SMUP ve frenik motor ünite numarası (MUNE) elde etmeye yönelik bir yaklaşımı tanımlamaktı. Ayrıca, frenik bir MN dejeneratif ajan olan saporine konjuge kolera toksin B fragmanının (CTB-SAP) intraplevral uygulamasını takiben diyafram MU sayısı kaybını vurgulayan temsili veriler sunuyoruz.

Protokol

Tüm prosedürler, Missouri Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak onaylandı ve yürütüldü. Deneyler, 11 ila 15 haftalık yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları üzerinde yapıldı. Bu sıçanlar çiftler halinde barındırıldı ve 12:12 aydınlık-karanlık döngüsü altında tutuldu, standart ticari peletlenmiş gıdalara ve HCl ile arıtılmış suya her zaman erişim sağlandı.

1. Hayvan hazırlama ve anestezi verme

1. Fareleri tutarken uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
2. Uygun indüksiyonu sağlamak için% 3-5 izofluran ile inhalasyon anestezisi uygulayın. Sıçan yeterince uyuşturulduktan sonra, sırtüstü pozisyona getirin ve% 1-3 inhale izofluran ile anesteziyi sürdürün. Geri çekilme yanıtı olmadığından emin olmak için forseps kullanarak arka bacak ayak pedine hafifçe baskı uygulayarak anestezi derinliğinin yeterliliğini kontrol edin.
   NOT: Sıçanın büyüklüğüne ve ağırlığına bağlı olarak, anestezi derinliğini izleyin ve izofluran konsantrasyonunu buna göre ayarlayın.
3. CMAP genliğini ve gecikmesini etkileyebilecek sıcaklık değişikliklerini önlemek için termostatik bir ısıtma plakası kullanarak sıcaklığı 37 °C'de tutun.
4. Kuruluğu önlemek için gözlere veteriner petrol bazlı bir merhem sürün. Solunum hızını gözlemleyerek ve forseps ile ayak tabanına baskı uyguladıktan sonra geri çekilme tepkilerini kontrol ederek anestezi derinliğini izleyin.
5. Makas kullanarak incelenecek olan göğsün ve boynun alt üçte birlik kısmından tüyleri alın. Tüm deney boyunca farenin solunumunu izleyin.
   NOT: CMAP ve MUNE kayıtlarını ve anestezinin kesilmesini takiben, yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar hayvanı ev kafesine geri koymayın.

2. Elektrot yerleşimi ve kurulumu

1. Şekil 28'de gösterildiği gibi CMAP, SMUP ve MUNE'yi kaydetmek için bir çift 1 G monopolar iğne elektrodu yerleştirin.
   1. Aktif (E1) iğne elektrodunu, son kaburga sınırının altındaki orta klaviküler çizginin üzerine deri altına ve referans (E2) iğne elektrodunu ksifoid işlemi ile son sternokostal kıkırdak arasındaki açıya deri altına yerleştirin.
      NOT: İğne elektrotları diyafram kasına yerleştirilmemelidir; bunun yerine deri altı bölgeye yerleştirilmelidirler.
2. Karotis tabakasındaki frenik sinirin uyarılması için, sinir stimülasyonu için katot ve anot olarak bir çift 28 G monopolar iğne elektrotu kullanın ve yaklaşık 1 cm ile ayrılarak ön ve orta skalen kasları arasında lateral boynun üzerine deri altına yerleştirin. Uyarıcı iğnelerin yerleşiminin dördüncü boyun omurlarının (C4) altındaki seviyede olduğundan emin olun.
   NOT: Frenik sinirin veya başka bir yapının yaralanmasını önlemek için uyarıcı elektrotları çok derine yerleştirmekten kaçının. Şekil 1'de elektrot yerleşimi gösterilmektedir.
3. Toprak elektrodu için kuyruğa tek kullanımlık bir yüzey elektrodu yerleştirin.

3. Veri toplama

1. Frenik CMAP
   1. Frenik siniri uyarmak için 0.1 ms süreli ve 60 ila 100 mA arasında değişen yoğunluğa sahip monofazik katodik kare dalga darbeleri uygulayarak frenik CMAP yanıtlarını kaydedin.
   2. Yanıtın genliği daha fazla artış göstermeyi bırakana kadar uyaran yoğunluğunu aşamalı olarak artırırken CMAP yanıtları elde edin. Supramaksimal stimülasyonu sağlamak için, uyaran yoğunluğunu maksimum bir yanıt ortaya çıkarmak için kullanılan seviyenin yaklaşık% 120'sine yükseltin ve ek bir yanıt kaydedin. CMAP boyutu artık artmıyorsa, bu yanıtı en yüksek CMAP olarak düşünün.
      NOT: CMAP kaydı sırasında eşzamanlı kas aktivitesi gürültüsünü en aza indirmek için ekshalasyon sırasında stimülasyon verilmesi tercih edilir.
   3. CMAP'nin tepeden tepeye genliklerini milivolt (mV) cinsinden ölçün ve belgeleyin (Şekil 2).
      NOT: CMAP genliği, tabandan tepeye ve tepeden tepeye değerlendirilebilir. Klinik elektrodiagnostik sistemler genellikle, izoelektrik taban çizgisinden ilk negatif tepe noktasına kadar hesaplanan tabandan tepeye değerlendirmek için varsayılan olarak kullanılır.
2. Ortalama tek motor ünitesi potansiyeli (SMUP) boyutu ve MUNE hesaplaması
   1. Artımlı bir stimülasyon tekniği kullanarak ortalama SMUP boyutunu hesaplayın.
      1. Artımlı yanıtları ortaya çıkarmak için, 1 Hz frekansında 0.1 ms'lik bir süre ile submaksimal stimülasyon uygulayın, minimal ya hep ya hiç yanıtı elde edilene kadar yoğunluğu 0.03 mA'lık artışlarla kademeli olarak artırın. 2 mA ile 10 mA arasında değişen bir uyaran yoğunluğu ile ilk yanıtı elde edin.
      2. İlk yanıt 2 mA ile 10 mA arasında bir uyaran yoğunluğu ile gerçekleşmezse, gerekli uyaran yoğunluğunu azaltmak veya artırmak için uyarıcı katodun pozisyonunu değiştirin, boyundaki frenik sinire yaklaştırın veya uzaklaştırın, sırasıyla.
      3. İlk artımlı yanıt, 2 mA ila 10 mA arasında değişen bir uyaran yoğunluğu ile elde edilirse, ilk yanıtı kaydedin ve adım 3.2.2'de aşağıdaki kriterleri karşılayan toplam 9 ek artış elde etmek için 0,03 mA'lık artışlarla ayarlayarak giderek daha yüksek uyaran yoğunluklarına sahip ek artışlar elde edin.
         NOT: Her SMUP, her bir artışın bir önceki artıştan çıkarılmasıyla ölçülür.
   2. Artımlı yanıtları ölçerken, her bir artışın aşağıdaki ölçütleri karşıladığından emin olun:
      1. Artımlı yanıtların ilk negatif tepe noktasının, maksimum CMAP yanıtının negatif tepe noktasıyla zamansal olarak hizalandığından emin olun.
         NOT: Solunum döngülerinden kaynaklanan arka plan gürültüsü nedeniyle gözlemlenen hafif hareketler, deneyin doğası gereğidir. Bununla birlikte, canlı gözlem sırasında SMUP'ların tutarlı bir şekilde bulunması, söz konusu belirli CMAP için kimliklerini doğrular.
      2. Diyafram solunumla ilgili dinamik bir kas olduğundan, her solunum döngüsü temel hareketi indükleyebilir. Bu nedenle, üç yinelenen yanıtta tutarlılığı onaylayarak her artımlı yanıtta kararlılığı ve fraksiyonlama olmadığını doğrulayın.
         NOT: Düşük genlikli uyarılmış potansiyelleri, özellikle ilk SMUP'u, solunum aktivitesine bağlı arka plan gürültüsünden ayırt etmek için, uyanık kalmak ve 3-4 solunum döngüsü boyunca gözlemlemek önemlidir. Ayrıca, doğruluk için tepe noktalarının CMAP'ninkilerle hizalandığından emin olun.
      3. Her artışın farklı ve bir öncekinden daha büyük olduğundan emin olun. Bu nedenle, artımlı yanıtları gerçek zamanlı olarak görsel olarak ayırt edin ve bunları daha önce kaydedilen artışların üzerine binerken gözlemleyin.
         NOT: Artışlarda tutarlılığı ve önceden tanımlanmış kriterlere uygunluğu sağlamak için her genlikte uyaranın birden fazla kopyası gerçekleştirilebilir.
      4. Her bir artışı yukarıda belirtilen kriterlerle görsel olarak doğruladıktan sonra, artış genliğinin en az 25 μV olduğunu onaylayın. Artış 25 μV'nin altındaysa, ölçümü atın ve yanıtı yeniden değerlendirin.
      5. 10 artımlı yanıtın kaydedilmesini takiben, her bir artış yanıtının genliğinin, son yanıtın toplam genliğini temsil eden 10 artışın tümünün birleşik genliğinin üçte birinden büyük olmadığını doğrulayın. Bu kriter karşılanmazsa, 10 artımlı yanıtın ölçümünü tekrarlayın.
         NOT: Üçte bir eşiği, her bir artımlı yanıtın tek bir motor ünitesinin aktivasyonunu temsil ettiği varsayımına dayanmaktadır. Herhangi bir artımlı yanıtın genliği, on artışın tümünün birleşik genliğinin üçte birini aşarsa, yanıtın yalnızca tek bir motor ünitesinin aktivasyonuna atfedilemeyebileceğini düşündürür. Bunun yerine, ek motor ünitelerin işe alınmasından veya elektriksel gürültü veya artefaktlar gibi spesifik olmayan aktivitelerin varlığından etkilenebilir^22,26.
      6. SMUP'ların ortalama genliğini tahmin etmek için, 10 artışın değerlerinin ortalamasını alın. Ortalama SMUP genliğini ölçmenin başka bir yöntemi, son artımlı yanıtın tüm genliğini toplam artış sayısına¹¹ bölmektir.
   3. Maksimum CMAP genliğini (tepeden tepeye) ortalama SMUP genliğine (tepeden tepeye) bölerek MUNE'yi belirleyin. Bazı elektrofizyolojik sistemlerde, SMUP'lar mikrovolt (μV) cinsinden kaydedilirken, CMAP genellikle milivolt (mV) cinsinden ifade edilir. Gerekirse, MUNE'yi hesaplamadan önce CMAP ve SMUP ölçümlerini aynı birimlere dönüştürün.
      NOT: Tepeden tepeye CMAP, ortalama SMUP ve MUNE tipik olarak klinik elektromiyografi sistemleri tarafından otomatik olarak hesaplanır:
      
      CMAP = Bileşik Kas Aksiyon Potansiyeli
      SMUP = Tek Motor Ünite Potansiyeli
      MUNE = Motor Birim Sayısı Tahmini

Sonuçlar

Bu raporda özetlenen CMAP, SMUP ve MUNE teknikleri, minimal invaziv elektrot yerleştirilerek diyafram kasındaki nöromüsküler fonksiyonun kaydedilmesini sağlar (Şekil 1). Genlik ve alan parametreleri, supramaksimal CMAP boyutunu karakterize etmek için kullanılabilir ve kas grubu çıktısının genel bir ölçüsünü sağlar (Şekil 2). Bununla birlikte, mevcut yöntemlerimizde, hem CMAP hem de SMUP boyutlarını ölç...

Tartışmalar

ALS gibi MN dejeneratif hastalıklarda, ventilasyonda yer alan MU'ların değerlendirilmesi çok önemlidir²⁸. ALS hastalarında respiratuar MN dejenerasyonu ortaya çıkmasına rağmen, MN ölümünün spesifik başlangıcı ve ilerlemesi tam olarak anlaşılamamıştır ^29,30,31. Bu yönün önemini kabul ederek, hem genetik temelli (örneğin, SOD1

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Glass Syringe	Kent Scientific Corporation	SOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN syringe	Hamilton Company	7637-01	Utilized to conduct intrapleural injection
5008 - Formulab Diet	LabDiet	0001325
Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°)	Hamilton Company	7804-04	Utilized to conduct intrapleural injection
Cholera toxin B-subunit (CTB)	MilliporeSigma	C9903	Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons
Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP)	Advanced Targeting Systems	IT-14	Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death
Detachable Cable	Technomed	202845-0000	to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads	Cadwell	302290-000	ground electrode
disposable monopolar needles 28 G	Technomed	202270-000	cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)	Cadwell	190266-200	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Isoflurane (250 mL bottle)	Piramal Healthcare
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corporation	PS-RT	Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Saporin (SAP)	Advanced Targeting Systems	PR-01	Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself)
Sierra Summit EMG system	Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA		portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SOMNO	Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Sprague-Dawley rat	Envigo colony 208a, Indianapolis, IN
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury