טכניקה שונה לגרימת תסמונת השחלות הפוליציסטיות בעכברים

Summary

פרוטוקול זה מציג טכניקה לגרימת מודלים של תסמונת השחלות הפוליציסטיות (PCOS) בעכברים באמצעות שחרור לטרוזול מבוקר באמצעות משאבות זעירות. תחת הרדמה מספקת, המשאבה הקטנה הושתלה תת עורית, ו- PCOS הושרה בהצלחה בעכברים לאחר תקופה מסוימת של שחרור המשאבה.

Abstract

תסמונת השחלות הפוליציסטיות (PCOS) היא אחד הגורמים המובילים לאי פוריות אצל נשים. מודלים של בעלי חיים נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד את המנגנונים האטיולוגיים של PCOS ופיתוח תרופות הקשורות. מודלים עכבריים המושרים על ידי Letrozole משכפלים את הפנוטיפים המטבוליים והרבייה של חולים עם PCOS. השיטה המסורתית של טיפול letrozole בעכברים PCOS דורש מינון יומי על פני תקופה מסוימת, אשר יכול להיות אינטנסיבי עבודה ולגרום מתח משמעותי לעכברים. מחקר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה לגרימת תסמונת השחלות הפוליציסטיות בעכברים על ידי השתלת מיני-משאבה מבוקרת המשחררת לטרוזול. משאבה זעירה המסוגלת לשחרר באופן יציב ורציף כמות כמותית של לטרוזול יוצרה והושתלה תת עורית בעכברים תחת הרדמה. מחקר זה הראה כי מודל העכבר חיקה בהצלחה תכונות PCOS לאחר השתלת משאבת מיני letrozole. החומרים והציוד המשמשים במחקר זה זמינים בקלות לרוב המעבדות, ואינם דורשים התאמה אישית מיוחדת. באופן קולקטיבי, מאמר זה מספק שיטה ייחודית וקלה לביצוע לגרימת PCOS בעכברים.

Introduction

תסמונת השחלות הפוליציסטיות (PCOS) היא אחת המחלות השכיחות ביותר בקרב נשים בגיל^{הפריון 1}. זה משפיע על עד 18% מהנשים ברחבי העולם והוא הגורם המוביל לאי פוריות האישה ברחבי העולם ^2,3. תסמונת השחלות הפוליציסטיות מאופיינת בסדרה של הפרעות במערכת הרבייה, כולל הפרשת גונדוטרופין מופרעת, אנובולציה כרונית, ייצור אנדרוגן מוגבר ומורפולוגיה של השחלות הפוליציסטיות⁴. בנוסף להפרעות גינקולוגיות, PCOS גם מגביר את הסיכון למחלות לב וכלי דם ^5,6. למרות עשרות שנים של מחקר, האטיולוגיה של PCOS נותרה לא ברורה ^7,8.

כדי לקבל תובנות טובות יותר על הפתוגנזה של PCOS ולפתח טיפולים חדשניים, יצירת מודלים של בעלי חיים המחקים באופן הדוק את הפיזיולוגיה האנושית היא בעלת חשיבות עצומה⁹. מודלים מכרסמים המדווחים כיום של PCOS כוללים אלה המושרים על ידי טיפולים עם טסטוסטרון, letrozole, ו estradiol valerate, בין היתר. טסטוסטרון גורם hyperandrogenemia והוא נפוץ יותר כמו PCOS משרה בחולדות¹⁰. DHEA שימש להשראת תסמונת השחלות הפוליציסטיות במכרסמים, להעלאת רמות הטסטוסטרון, ליחס LH/FSH (הורמון מחלוטיניזציה/הורמון מגרה זקיקים) ולגרימת מחזורי ייחום לא סדירים¹¹. אסטרדיול ואלרט (EV) הוא אסטרוגן ארוך טווח, ומחקרים המשתמשים בשיטה זו מראים כי רמות הורמוני סטרואידים וגונדוטרופינים משתנות בהתאם למינון של EV המנוהל 12,13,14. Letrozole הוא מעכב ארומטאז nonsteroidal¹⁵. טיפול בלטרוזול משרה ייחום לא מחזורי, מעלה את משקל השחלות, משקל הגוף, מגדיל אדיפוציטים, ממקסם את התפתחות הזקיקים ומעלה את רמות הטסטוסטרון בחולדות^16,17. עכברים שטופלו בלטרוזול מציגים מספר מוגבר של זקיקי סינוסים וציסטות דימומות, כמו גם ריכוזים גבוהים של LH, FSH, אסטרדיול ופרוגסטרון^18,19.

נכון לעכשיו, השיטות העיקריות עבור מודלים PCOS המושרה letrozole כוללים מתן דרך הפה הזרקה תת עורית, שניהם דורשים מינון יומי חוזר 20,21,22. שיטות אלה גוזלות זמן רב ודורשות עבודה, וסביר להניח שמתן חוזר ונשנה גורם ללחץ משמעותי לבעלי החיים²³ . למרות כמה מחקרים להשתמש כדורי letrozole^24,25, מוצרים אלה צריכים להיות מותאמים אישית והם יקרים. דוח זה מתאר טכניקה לגרימת PCOS בעכברים באמצעות משאבות זעירות. שיטה זו פשוטה, חוסכת זמן ומשתמשת בכלים ובציוד כירורגי הזמינים ברוב המעבדות.

Protocol

כל הפרוטוקולים לניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת פודאן. נקבות עכברי C57BL/6J, בנות 4 שבועות, שימשו כאן. פרטי בעלי החיים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת משאבת המיני

1. קח את אבקת letrozole (50 מ"ג) מאוחסן בבקבוק האריזה המקורי, צנטריפואת אבקת letrozole בבקבוק ב 300 x גרם במשך 5 s (בטמפרטורת החדר), ולאחר מכן לפתוח את הפקק.
2. להוסיף לאט 625 μL של DMSO אבקת letrozole עם פיפטה ולערבב היטב כדי לקבל פתרון מלאי בריכוז של 8 מ"ג / 100 μL, בסך הכל 625 μL.
   הערה: אם אתה משתמש בגודל אריזה שונה של אבקת letrozole, חשב מראש את הנפח הנדרש של DMSO כדי להגדיר את פתרון המלאי. אבקת letrozole, DMSO, ותרכובות קשורות אחרות חייב להיות ברמה סטרילית. קצות הפיפטה, הצינורות ופריטים קשורים אחרים צריכים להיות סטריליים או מעוקרים לפני השימוש.
3. ספור את מספר העכברים הדרושים בהתאם לתכנון הניסוי.
4. צייר את הכמות הכוללת של תמיסת מלאי letrozole הנדרשת עם פיפטה, בהתאם למספר העכברים הנדרש, והזריק אותו לתוך צינור הצנטריפוגה לאט.
   הערה: עכברים בני 4 שבועות לחשיפה של 8 שבועות נבחרו כדי לגרום למודל עכברי PCOS. המינון הכולל של letrozole הוא 8 מ"ג עבור כל עכבר, אשר דורש שתי משאבות רצופות להשתיל (משאבה אחת משתחררת במשך 4 שבועות), כלומר, 4 מ"ג / 4 שבועות לכל משאבה. כפי שהוזכר בשלב 1.2, הריכוז של תמיסת מלאי letrozole הוא 8 מ"ג / 100 μL. כדי להכין את המשאבות, 50 מיקרוליטר של תמיסת מלאי נדרשת עבור כל משאבה כפי שמחושב להלן: סך של 4 מ"ג letrozole חלקי 8 מ"ג / 100 μL.
5. ציירו כמות שווה של PEG300, הוסיפו אותו לתמיסת הלטרוזול, וערבבו היטב (ניתן לערבל אותו כראוי).
6. הכן את פתרון רכב הבקרה עבור קבוצת הבקרה (50 μL של DMSO + 50 μL של PEG300 עבור כל משאבה ללא letrozole).
7. להכין מספר נאות של צינורות צנטריפוגות סטריליות בהתאם למספר המשאבות הנדרשות; צינור צנטריפוגה אחד של 15 מ"ל צריך להיות מוכן לכל משאבה.
8. צייר מלוחים עם מזרק ולהוסיף 5 מ"ל של מלוחים לכל צינור צנטריפוגה. לאחר מכן, סגרו את צינורות הצנטריפוגות והניחו אותם על מדף צינורות לשימוש נוסף.
9. לבשו זוג חדש של כפפות סטריליות, הוציאו את המשאבות הקטנות בכמות הרצויה והניחו אותן על משטח או מיכל נקי וסטרילי.
10. צבטו בעדינות את המכסה המתאים לגוף המשאבה עם האגודל והאצבע, והחזיקו את גוף המשאבה ביד השנייה.
11. חיטטו באיטיות בפתח המילוי של המשאבה מספר פעמים עם הצינור הדק המחובר למכסה (איור 1B).
    הערה: אם לא סתום, ייתכן שהנוזל לא יזרום בחופשיות בצינור לאחר המילוי.
12. קח את המחט המתאימה למשאבה מזרק סטרילי 1 מ"ל. חברו את המחט למזרק והפכו אותו להדוק (איור 1C).
13. ציירו בזהירות ובאיטיות את הפתרון הסופי של letrozole שהוגדר לעיל עם המזרק החדש שהורכב (איור 1D).
    הערה: השאיפה של פתרון letrozole צריך להיעשות לאט ובאופן שווה. שאיפה מהירה עלולה ליצור בועות אוויר, אשר עשויות להשפיע על הזרקת תמיסת התרופה לאחר מכן.
14. הזריקו את תמיסת הלטרוזול לתוך המיני-משאבה.
    1. צבטו בזהירות משאבה קטנה ביד אחת כך שתעמוד זקופה, וביד השנייה החזיקו את מזרק 1 מ"ל שהוזכר לעיל והכניסו אותו באיטיות לתחתית המשאבה (איור 1E).
       הערה: אם המחט אינה מוחדרת לתחתית המשאבה, הנוזל במשאבה יכול בקלות לבעבע במהלך ההזרקה, מה שישפיע על שחרור התרופה לאחר מכן על ידי המשאבה.
    2. לאחר מכן להזריק לאט את הפתרון המוגדר; ניתן להבחין בהזרקה כאשר פתיחת המשאבה מבעבעת מעט.
    3. יש להזריק לאט יותר כאשר נפח ההזרקה מתקרב ל-90 מיקרוליטר. לאחר שהמשאבה מלאה במלואה (כ-100 מיקרוליטר), משכו את המזרק.
    4. בזהירות להכניס את המכסה לתוך גוף המשאבה ולעשות אותו הדוק; בשלב זה, כמות קטנה של פתרון תישפך החוצה. נגבו אותו בזהירות.
15. קחו את המשאבה עמוסה בתרופה, כשהשקע פונה כלפי מעלה (הקצה עם הפקק), קחו את צינור הצנטריפוגה שהוכן קודם לכן, וטבלו את המשאבה במלח סטרילי (איור 1F). לאחר מכן, סגרו את צינור הצנטריפוגה והניחו אותו על מדף הצינורות.
    הערה: יש להקפיד להימנע מזיהום המשאבה לאורך כל התהליך.
16. לאחר כל משאבות מיני נעשים, מניחים את כל צינורות הצנטריפוגה בתרמוסטט 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

2. הכנה לפעולה והרדמה

1. הכינו ועיקרו את כל המכשירים הנדרשים ביום הניתוח, כולל מלקחיים, המוסטטים, מספריים כירורגיים, מחזיקי מחטים ותפרים כירורגיים נספגים 4-0.
2. לפני השימוש במכשיר ההרדמה איזופלורן (איור 2B), בדקו היטב אם חיבור הצינור תקין וודאו שהצינור שלם ואינו דולף.
3. פתחו את פקק האיטום של המילוי במאייד של מכונת ההרדמה, ולאחר מכן הוסיפו לאט את חומר ההרדמה.
4. שמור על רמת ההרדמה בין הגבול העליון לגבול התחתון המסומן על מכונת ההרדמה.
5. המר את מתג השסתום התלת-כיווני כדי להבטיח שזרימת האוויר מהמאייד של מכונת ההרדמה מחוברת לקופסת השראת ההרדמה.
6. פתחו את משאבת האוויר ואת המאייד, ולאחר מכן התאימו את ריכוז האיזופלורן להשראת הרדמה (בדרך כלל 3%-4%).
7. המתן כדקה עד שההרדמה תמלא את קופסת הזירוז, ואז הכנס את העכבר לקופסת האינדוקציה והמתן עד להרדמה מלאה (תהליך זה לוקח בערך 2-3 דקות).
8. בדקו שהעכברים מורדמים כראוי על ידי הטייה עדינה של הקופסה. אם העכברים מתהפכים ואינם מראים סימני חזרה למצב שכיבה, מתבצעת הרדמה.

3. השתלת משאבת מיני letrozole

1. שימו מסכה כירורגית וכפפות סטריליות.
2. הסר את העכברים שהורדמו מראש מקופסת האינדוקציה ומרח את קרם ההידור על גב העכברים, ולאחר מכן המתן דקה אחת. נגבו בעדינות את קרם ההידור והשיער עם גזה רטובה.
3. במקביל, החליפו את מתג השסתום התלת-כיווני כדי לוודא שזרימת האוויר מהמאייד של מכונת ההרדמה מחוברת למסיכת ההרדמה והתאימו את ריכוז התחזוקה (בדרך כלל 2%).
4. לאחר הסרת השיער, החזיקו את העכבר ביד הדומיננטית והכניסו את ראשו/אפו לתוך מסכת ההרדמה.
5. בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הגמילה מהדוושה.
   הערה: כל ההליכים הכרוכים בהרדמה חייבים להתבצע באמצעות מסנני גז המצוידים בטבליות פחם פעיל, וההליך צריך להתבצע במכסה אדים.
6. אבטח את העכבר במצב נוטה על לוח הניתוח ומרח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים.
7. מרחו מקלוני פובידון-יוד שלוש פעמים על העור החשוף (איור 2C). לאחר מכן, להזריק meloxicam תת עורית במינון של 2 מ"ג / ק"ג.
8. אשר שוב את עומק ההרדמה באמצעות צביטת בוהן. לאחר מכן, בקו האמצע של החלק האחורי של הצוואר, העדיפו את העור בצד חסר השיער, הרימו את העור עם מלקחיים ובצעו חתך של כ-0.5 ס"מ לרוחב בעזרת אזמל או מספריים כירורגיים (איור 2D).
9. לאחר מכן פתחו את האפידרמיס שמתחת לחתך וגשו אליו עם המוסטאט או מחזיק מחט כדי לשחרר את העור, ופנו מקום למיני-משאבה (במרחק של כ-2 ס"מ מהחתך) (איור 2E).
10. הוציאו את המשאבה מהמלח בצינור הצנטריפוגה בעזרת מלקחיים סטריליים, כשהקצה הפתוח של המשאבה פונה כלפי מטה, והיו מוכנים להחדיר את המשאבה באופן תת-עורי לעכברים (איור 2F).
11. הדקו צד אחד של חתך העור במלקחיים ודחפו את המשאבה לחלל התת עורי. לא אמורה להיות התנגדות בעת הכניסה למשאבה. ברגע שאתם בפנים, השתמשו באצבעות כדי ללחוץ מעט ובעדינות את המשאבה פנימה ככל האפשר (איור 1G).
12. תפרו את מקום החתך בזהירות באמצעות 4-0 תפרים כירורגיים (איור 2H).
    הערה: יש להקפיד שלא לפגוע בגוף המשאבה התת עורית בעת התפירה.
13. לאחר התפירה, לחטא את העור באתר הניתוח פעמיים עם מקלוני יודופור.

4. התאוששות בעלי חיים

1. לאחר הניתוח, העבירו בעדינות את העכברים מהמזרן המשמש במהלך ההרדמה למזרן יבש ונקי. ודאו שהעכברים נמצאים בסביבה חמה ושקטה.
2. עקוב מקרוב אחר תנאי העכברים, כגון עומק ותדירות נשימותיהם.
3. שימו לב להתנהגות העכברים כאשר הניידות שלהם מתחילה לחזור. לבסוף, ודא שהם יכולים לעמוד וללכת ללא התנהגויות חריגות ברורות כגון סחרחורת או תנועות לא מתואמות.
4. לאחר שהעכברים התאוששו, העבירו אותם בעדינות לכלובים מוכנים מראש. הניחו ג'לי סטרילי ומזון בתחתית הכלוב כדי שהעכברים יוכלו להיזון ממנו.
   הערה: מתיחה של אתר הניתוח עשויה למנוע מהעכברים לשתות ולאכול בקלות בתקופה המוקדמת שלאחר הניתוח, לכן יש להניח ג'לי ומזון בתחתית הכלוב.
5. יש להזריק מלוקסיקם תת עורית במינון של 2 מ"ג/ק"ג (כל 24 שעות במשך 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח). לאחר 8 שבועות של טיפול בלטרוזול (כלומר, שתי השתלות מיני-משאבה רצופות), בדקו את דגמי העכברים.

תוצאות

פרוטוקול הניסוי וכמה שלבים קריטיים מוצגים באיור 1 ובאיור 2. רמות טסטוסטרון בסרום מוצגות באיור 3A. עכברי Letrozole שטופלו במיני משאבה (להלן עכברי LTZ) הפגינו רמות טסטוסטרון גבוהות משמעותית בסרום בהשוואה לעכברי ביקורת נקבות. בינתי?...

Discussion

דו"ח זה מדגים פרוטוקול פשוט לגרימת PCOS בעכברים באמצעות חומרים נגישים בקלות. מודל PCOS עכבר חיוני לחקר מנגנוני PCOS ותרופות סינון²⁶. מבין השיטות הזמינות להשראת מודלים PCOS בעכברים, השראת letrozole היא אחת הנפוצות ביותר. השימוש letrozole יכול לפתח ולתחזק מצב hyperandrogenic על ידי עי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syringe	Bofeng Biotech	BD300841	1ML (sterile)
Centrifugation tube	Biological Hope	1850-K	15ML (sterile)
Pipette	Eppendorf	3123000268-A	100μL-1000μL (sterile)
Pipette	TopPette	7010101008	10μL-100μL (sterile)
Letrozole powder	Sigma	L6545-50MG	Primary acting drugs (sterile)
PEG(Poly(ethylene glycol))	Solarbio	P8250	Used for dissolution (sterile)
Sterile Physiological Saline Solution	Biosharp	BL158A	Mini-pump storage
Osmotic Pumps	ALZET	1004	Letrozole storage and sustained release (sterile)
Dimethyl sulfoxide	Biosharp	BS087	Used for dissolution (sterile)
Small Animal Anesthesia Machine	RWD	R500IP	Used for anesthesia
Isoflurane	RWD	20071302	Used for anesthesia
Hemostats	Biosharp	BS-HF-S-125	Surgical instrument
Scissors	Biosharp	BS-SOR-S-100P	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32010	Surgical instrument
Forceps	RWD	F12028	Surgical instrument
Needle and the 4-0 absorbable suture	JINGHUAN	CR413	Surgical instrument
Povidone-iodine swabs	SingleLady	GB26368-2010	Skin disinfection
Depilatory cream	ZIKER BIOTECHNOLOGY	ZK-L2701	Depilation agent for laboratory animals
Nitrile Gloves	Biosharp	BC040-L	Used for aseptic operation
Sterile gauze	ZHENDE	BA69087	Used for wiping liquids
C57BL/6J Mice	Shanghai Model Organisms Center	N/A	Age: 4 weeks
Pet Eye Lubricant	BAITE	SHF021153	Used for mouse eye lubricant
Meloxicam Injection	MEIDAJIA	R21064-21	Used for mouse analgesia (sterile)