Una técnica modificada para inducir el síndrome de ovario poliquístico en ratones

Resumen

Este protocolo introduce una técnica para inducir modelos de síndrome de ovario poliquístico (SOP) en ratones mediante la liberación controlada de letrozol utilizando minibombas. Bajo la anestesia adecuada, la minibomba se implantó por vía subcutánea y se indujo con éxito el SOP en los ratones después de un cierto período de liberación de la minibomba.

Resumen

El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es una de las principales causas de infertilidad en las mujeres. Los modelos animales se utilizan ampliamente para estudiar los mecanismos etiológicos del síndrome de ovario poliquístico y para el desarrollo de fármacos relacionados. Los modelos de ratón inducidos por letrozol replican los fenotipos metabólicos y reproductivos de los pacientes con SOP. El método tradicional de tratamiento con letrozol en ratones con SOP requiere una dosis diaria durante un cierto período, lo que puede ser laborioso y causar un estrés significativo a los ratones. Este estudio describe un método sencillo y eficaz para inducir el síndrome de ovario poliquístico en ratones mediante la implantación de una minibomba liberadora de letrozol controlada. Se fabricó una minibomba capaz de liberar de forma estable y continua una cantidad cuantitativa de letrozol y se implantó por vía subcutánea en ratones bajo anestesia. Este estudio demostró que el modelo de ratón imitó con éxito las características del SOP después de la implantación de la minibomba de letrozol. Los materiales y equipos utilizados en este estudio están fácilmente disponibles para la mayoría de los laboratorios, sin necesidad de una personalización especial. En conjunto, este artículo proporciona un método único y fácil de realizar para inducir el SOP en ratones.

Introducción

El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es una de las afecciones más comunes entre las mujeres en edad reproductiva¹. Afecta hasta el 18% de las mujeres a nivel mundial y es la principal causa de infertilidad femenina en todo el mundo ^2,3. El síndrome de ovario poliquístico se caracteriza por una serie de anomalías reproductivas interrelacionadas, como la secreción alterada de gonadotropinas, la anovulación crónica, el aumento de la producción de andrógenos y la morfología ovárica poliquística⁴. Además de los trastornos ginecológicos, el síndrome de ovario poliquístico también aumenta el riesgo de enfermedades cardiovasculares ^5,6. A pesar de décadas de investigación, la etiología del SOP sigue sin estar clara ^7,8.

Para obtener una mejor comprensión de la patogénesis del síndrome de ovario poliquístico y desarrollar nuevas terapias, la creación de modelos animales que imiten de cerca la fisiología humana es de gran importancia⁹. Los modelos de SOP en roedores reportados actualmente incluyen aquellos inducidos por tratamientos con testosterona, letrozol y valerato de estradiol, entre otros. La testosterona induce hiperandrogenemia y se utiliza más comúnmente como inductor del SOP en ratas¹⁰. La DHEA se ha utilizado para inducir el síndrome de ovario poliquístico en roedores, aumentando los niveles de testosterona, las proporciones de LH / FSH (hormona luteinizante / hormona estimulante del folículo) y causando ciclos estrales irregulares¹¹. El valerato de estradiol (EV) es un estrógeno de acción prolongada, y los estudios que utilizan este método muestran que los niveles de hormonas esteroides sexuales y gonadotropinas varían dependiendo de la dosis de EV administrada 12,13,14. El letrozol es un inhibidor no esteroideo de la aromatasa¹⁵. El tratamiento con letrozol induce el estro no cíclico, aumenta el peso ovárico, el peso corporal, agranda los adipocitos, maximiza el desarrollo de los folículos y eleva los niveles de testosterona en ratas^16,17. Los ratones tratados con letrozol presentan un mayor número de folículos sinusales y quistes hemorrágicos, así como concentraciones elevadas de LH, FSH, estradiol y progesterona ^18,19.

En la actualidad, los principales métodos para el modelado del SOP inducido por letrozol incluyen la administración oral y la inyección subcutánea, las cuales requieren dosis diarias repetidas 20,21,22. Estos métodos requieren mucho tiempo y mano de obra, y es probable que la administración repetitiva cause un estrés significativo a los animales²³. A pesar de que algunos estudios utilizan pellets de letrozol^24,25, estos productos necesitan ser personalizados y son caros. En este informe se describe una técnica para inducir el síndrome de ovario poliquístico en ratones mediante minibombas. Este método es simple, ahorra tiempo y utiliza herramientas y equipos quirúrgicos que están disponibles en la mayoría de los laboratorios.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales con animales de este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Fudan. Aquí se utilizaron ratones hembra C57BL/6J, de 4 semanas de edad. Los detalles de los animales, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la minibomba

1. Tome el polvo de letrozol (50 mg) almacenado en el frasco de embalaje original, centrifugue el polvo de letrozol en el frasco a 300 x g durante 5 s (a temperatura ambiente) y luego abra el tapón.
2. Agregue lentamente 625 μL de DMSO al polvo de letrozol con una pipeta y mezcle bien para obtener una solución madre a una concentración de 8 mg/100 μL, totalizando 625 μL.
   NOTA: Si utiliza un tamaño de paquete diferente de polvo de letrozol, calcule el volumen requerido de DMSO con anticipación para configurar la solución madre. El polvo de letrozol, el DMSO y otros compuestos relacionados deben ser de grado estéril. Las puntas de pipeta, los tubos y otros elementos relacionados deben ser estériles o esterilizados antes de su uso.
3. Cuente el número de ratones requeridos de acuerdo con el diseño experimental.
4. Extraiga la cantidad total de solución madre de letrozol necesaria con una pipeta, en función del número de ratones necesarios, e inyéctese lentamente en el tubo de centrífuga.
   NOTA: Se seleccionaron ratones de 4 semanas de edad para una exposición de 8 semanas para inducir el modelo de ratones con SOP. La dosis total de letrozol es de 8 mg por cada ratón, lo que requiere la implantación de dos bombas consecutivas (una bomba se libera durante 4 semanas), es decir, 4 mg/4 semanas por bomba. Como se mencionó en el paso 1.2, la concentración de la solución madre de letrozol es de 8 mg/100 μL. Para preparar las bombas, se requieren 50 μL de solución madre para cada bomba como se calcula a continuación: un total de 4 mg de letrozol dividido por 8 mg/100 μL.
5. Extraiga una cantidad igual de PEG300, agréguelo a la solución de letrozol y mezcle bien (se puede vórtice adecuadamente).
6. Prepare la solución del vehículo de control para el grupo de control (50 μL de DMSO + 50 μL de PEG300 para cada bomba sin letrozol).
7. Prepare un número adecuado de tubos de centrífuga estériles de acuerdo con el número de bombas requeridas; Es necesario preparar un tubo de centrífuga de 15 ml para cada bomba.
8. Extraiga solución salina con una jeringa y agregue 5 ml de solución salina a cada tubo de centrífuga. Luego, tape los tubos de centrífuga y colóquelos en una rejilla de tubos para su uso posterior.
9. Use un nuevo par de guantes estériles, saque las minibombas en la cantidad deseada y colóquelas sobre una encimera o recipiente limpio y estéril.
10. Pellizque suavemente la tapa que coincide con el cuerpo de la bomba con el pulgar y el índice, y sostenga el cuerpo de la bomba con la otra mano.
11. Empuje lentamente el puerto de llenado de la bomba varias veces con el tubo delgado conectado a la tapa (Figura 1B).
    NOTA: Si no está desobstruido, es posible que el líquido no fluya libremente en el tubo después del llenado.
12. Tome la aguja que coincida con la bomba y una jeringa estéril de 1 mL. Conecte la aguja a la jeringa y apriétela (Figura 1C).
13. Elabore cuidadosa y lentamente la solución final de letrozol configurada anteriormente con la jeringa recién ensamblada (Figura 1D).
    NOTA: La aspiración de la solución de letrozol debe realizarse de manera lenta y uniforme. La aspiración rápida puede generar burbujas de aire, que pueden afectar la posterior inyección de la solución del fármaco.
14. Inyecte la solución de letrozol en la minibomba.
    1. Presione con cuidado una minibomba con una mano para que quede en posición vertical y, con la otra mano, sostenga la jeringa de 1 ml antes mencionada e insértela lentamente en la parte inferior de la bomba (Figura 1E).
       NOTA: Si la aguja no se inserta en la parte inferior de la bomba, el líquido de la bomba puede burbujear fácilmente durante la inyección, lo que afectará la liberación posterior del medicamento por parte de la bomba.
    2. A continuación, inyecte lentamente la solución configurada; La inyección se puede notar cuando la apertura de la bomba burbujea ligeramente.
    3. Inyecte más lentamente cuando el volumen de inyección se acerque a 90 μL. Una vez que la bomba esté completamente llena (aproximadamente 100 μL), retire la jeringa.
    4. Inserte con cuidado la tapa en el cuerpo de la bomba y hágala hermética; En este punto, se derramará una pequeña cantidad de solución. Límpialo con cuidado.
15. Tome la bomba cargada con el medicamento, con la salida hacia arriba (el extremo con la tapa), tome el tubo de centrífuga previamente preparado y sumerja completamente la bomba en solución salina estéril (Figura 1F). Luego, tape el tubo de centrífuga y colóquelo en la rejilla de tubos.
    NOTA: Tenga cuidado de evitar contaminar la bomba durante todo el proceso.
16. Una vez fabricadas todas las minibombas, coloque todos los tubos de centrífuga en un termostato de 37 °C durante 48 h.

2. Preparación para la operación y anestesia

1. Prepare y esterilice todos los instrumentos necesarios el día de la cirugía, incluidos fórceps, hemostáticos, tijeras quirúrgicas, portaagujas y suturas quirúrgicas absorbibles 4-0.
2. Antes de usar la máquina de anestesia con isoflurano (Figura 2B), verifique cuidadosamente si la conexión de la tubería es correcta y asegúrese de que la tubería esté intacta y no tenga fugas.
3. Desenrosque la tapa de sellado de llenado en el evaporador de la máquina de anestesia, luego agregue lentamente el anestésico.
4. Mantenga el nivel de anestesia entre los límites superior e inferior etiquetados en la máquina de anestesia.
5. Convierta el interruptor de válvula de tres vías para garantizar que el flujo de aire del evaporador de la máquina de anestesia esté conectado a la caja de inducción de anestesia.
6. Abra la bomba de aire y el evaporador, luego ajuste la concentración de isoflurano para la inducción de la anestesia (generalmente 3%-4%).
7. Espere aproximadamente 1 minuto hasta que el anestésico llene la caja de inducción, luego coloque el mouse en la caja de inducción y espere hasta que se complete la anestesia (este proceso tarda aproximadamente 2-3 minutos).
8. Compruebe que los ratones están adecuadamente anestesiados inclinando suavemente la caja. Si se da la vuelta a los ratones y no muestran signos de volver a la posición recostada, se induce la anestesia.

3. Implantación de la minibomba de letrozol

1. Colóquese una mascarilla quirúrgica y guantes estériles.
2. Retire los ratones preanestesiados de la caja de inducción y aplique la crema depilatoria en la parte posterior de los ratones, luego espere 1 minuto. Limpie suavemente la crema depilatoria y el cabello con una gasa húmeda.
3. Al mismo tiempo, cambie el interruptor de la válvula de tres vías para asegurarse de que el flujo de aire del evaporador de la máquina de anestesia esté conectado a la máscara de anestesia y ajuste la concentración de mantenimiento (generalmente 2%).
4. Después de depilar, sostenga el ratón con la mano dominante y coloque su cabeza/nariz en la máscara de anestesia.
5. Compruebe la profundidad de la anestesia probando el reflejo de retirada del pedal.
   NOTA: Todos los procedimientos que involucran anestesia deben realizarse utilizando filtros de gas equipados con tabletas de carbón activado, y el procedimiento debe realizarse en una campana extractora.
6. Asegure el mouse en posición prona en la placa de operación y aplique lubricante ocular en ambos ojos.
7. Aplique hisopos de povidona yodada tres veces sobre la piel expuesta (Figura 2C). A continuación, inyecte meloxicam por vía subcutánea a una dosis de 2 mg/kg.
8. Confirme la profundidad del anestésico mediante un pellizco en el dedo del pie nuevamente. A continuación, en la línea media de la nuca, favoreciendo la piel del lado sin pelo, recoger la piel con pinzas y hacer una incisión de aproximadamente 0,5 cm lateralmente con un bisturí o unas tijeras quirúrgicas (Figura 2D).
9. A continuación, abra la epidermis por debajo de la incisión y acceda a ella con un hemostático o un portaagujas para liberar la piel, dejando espacio para una minibomba (a unos 2 cm de distancia de la incisión) (Figura 2E).
10. Saque la bomba de la solución salina en el tubo de centrífuga con pinzas estériles, con el extremo abierto de la bomba hacia abajo, y esté preparado para insertar la bomba por vía subcutánea en los ratones (Figura 2F).
11. Sujete un lado de la incisión cutánea con pinzas y empuje la bomba hacia el espacio subcutáneo. No debe haber resistencia al entrar en la bomba. Una vez dentro, utilice los dedos para apretar ligera y suavemente la bomba hacia adentro tanto como sea posible (Figura 1G).
12. Suturar cuidadosamente el sitio de la incisión con suturas quirúrgicas 4-0 (Figura 2H).
    NOTA: Tenga cuidado de no dañar el cuerpo de la bomba subcutánea al suturar.
13. Después de la sutura, desinfecte la piel en el sitio quirúrgico dos veces con hisopos de yodóforo.

4. Recuperación de animales

1. Después de la cirugía, transfiera suavemente los ratones del colchón utilizado durante la anestesia a un colchón seco y limpio. Asegúrese de que los ratones estén en un ambiente cálido y tranquilo.
2. Vigila de cerca las condiciones de los ratones, como la profundidad y la frecuencia de sus respiraciones.
3. Observe el comportamiento de los ratones a medida que su movilidad comienza a regresar. Por último, asegúrese de que pueda ponerse de pie y caminar sin comportamientos anormales evidentes, como mareos o movimientos descoordinados.
4. Una vez que los ratones se hayan recuperado, transfiéralos suavemente a jaulas preparadas previamente. Coloque gelatina estéril y comida en el fondo de la jaula para que los ratones se alimenten.
   NOTA: El estiramiento del sitio quirúrgico puede evitar que los ratones beban y coman fácilmente durante el período postoperatorio temprano, así que coloque gelatina y comida en el fondo de la jaula.
5. Inyectar meloxicam por vía subcutánea a una dosis de 2 mg/kg (cada 24 h durante los 3 primeros días después de la cirugía). Después de 8 semanas de tratamiento con letrozol (es decir, dos implantes consecutivos de minibombas), pruebe los modelos de ratones.

Resultados

El protocolo experimental y algunos pasos críticos se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. Los niveles séricos de testosterona se muestran en la Figura 3A. Los ratones tratados con letrozol con minibomba (en lo sucesivo denominados ratones LTZ) mostraron niveles de testosterona sérica significativamente elevados en comparación con los ratones de control hembra. Mientras tanto, el análisis his...

Discusión

Este informe muestra un protocolo simple para inducir el síndrome de ovario poliquístico en ratones utilizando materiales de fácil acceso. El modelo de SOP en ratones es esencial para explorar los mecanismos del SOP y el cribado de fármacos²⁶. De los métodos disponibles para inducir modelos de SOP en ratones, la inducción de letrozol es uno de los más utilizados. El uso de letrozol puede desarrollar y mantener una condición hiperandrogénica al inhibir la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syringe	Bofeng Biotech	BD300841	1ML (sterile)
Centrifugation tube	Biological Hope	1850-K	15ML (sterile)
Pipette	Eppendorf	3123000268-A	100μL-1000μL (sterile)
Pipette	TopPette	7010101008	10μL-100μL (sterile)
Letrozole powder	Sigma	L6545-50MG	Primary acting drugs (sterile)
PEG(Poly(ethylene glycol))	Solarbio	P8250	Used for dissolution (sterile)
Sterile Physiological Saline Solution	Biosharp	BL158A	Mini-pump storage
Osmotic Pumps	ALZET	1004	Letrozole storage and sustained release (sterile)
Dimethyl sulfoxide	Biosharp	BS087	Used for dissolution (sterile)
Small Animal Anesthesia Machine	RWD	R500IP	Used for anesthesia
Isoflurane	RWD	20071302	Used for anesthesia
Hemostats	Biosharp	BS-HF-S-125	Surgical instrument
Scissors	Biosharp	BS-SOR-S-100P	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32010	Surgical instrument
Forceps	RWD	F12028	Surgical instrument
Needle and the 4-0 absorbable suture	JINGHUAN	CR413	Surgical instrument
Povidone-iodine swabs	SingleLady	GB26368-2010	Skin disinfection
Depilatory cream	ZIKER BIOTECHNOLOGY	ZK-L2701	Depilation agent for laboratory animals
Nitrile Gloves	Biosharp	BC040-L	Used for aseptic operation
Sterile gauze	ZHENDE	BA69087	Used for wiping liquids
C57BL/6J Mice	Shanghai Model Organisms Center	N/A	Age: 4 weeks
Pet Eye Lubricant	BAITE	SHF021153	Used for mouse eye lubricant
Meloxicam Injection	MEIDAJIA	R21064-21	Used for mouse analgesia (sterile)