Модифицированная методика индуцирования синдрома поликистозных яичников у мышей

Резюме

Этот протокол представляет собой технику индукции моделей синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) у мышей с помощью контролируемого высвобождения летрозола с помощью мини-насосов. Под адекватной анестезией мини-помпа была имплантирована подкожно, и СПКЯ был успешно индуцирован у мышей после определенного периода выпуска мини-помпы.

Аннотация

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является одной из ведущих причин бесплодия у женщин. Животные модели широко используются для изучения этиологических механизмов СПКЯ и для разработки связанных с ним лекарств. Мышиные модели, индуцированные летрозолом, воспроизводят метаболические и репродуктивные фенотипы пациентов с СПКЯ. Традиционный метод лечения летрозолом у мышей с СПКЯ требует ежедневного дозирования в течение определенного периода, что может быть трудоемким и вызывать значительный стресс у мышей. В этом исследовании описан простой и эффективный метод индуцирования СПКЯ у мышей путем имплантации контролируемого мини-насоса, высвобождающего летрозол. Мини-насос, способный стабильно непрерывно высвобождать количественное количество летрозола, был изготовлен и имплантирован подкожно мышам под наркозом. Это исследование показало, что мышиная модель успешно имитировала особенности СПКЯ после имплантации мини-помпы летрозола. Материалы и оборудование, использованные в этом исследовании, легко доступны для большинства лабораторий и не требуют специальной настройки. В совокупности эта статья представляет собой уникальный, простой в исполнении метод индуцирования СПКЯ у мышей.

Введение

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является одним из наиболее распространенных состояний среди женщин репродуктивного возраста¹. Он поражает до 18% женщин во всем мире и является основной причиной женского бесплодия во всем мире ^2,3. СПКЯ характеризуется рядом взаимосвязанных репродуктивных аномалий, включая нарушение секреции гонадотропинов, хроническую ановуляцию, повышенную выработку андрогенов и морфологию поликистозных яичников⁴. Помимо гинекологических нарушений, СПКЯ также повышает риск сердечно-сосудистых заболеваний ^5,6. Несмотря на десятилетия исследований, этиология СПКЯ остается неясной ^7,8.

Для лучшего понимания патогенеза СПКЯ и разработки новых методов лечения^{огромное значение имеет} создание животных моделей, которые точно имитируют физиологию человека. В настоящее время сообщается, что модели СПКЯ у грызунов включают модели, вызванные лечением тестостероном, летрозолом и эстрадиола валератом, среди прочих. Тестостерон вызывает гиперандрогению и чаще используется в качестве индуктора СПКЯ у^крыс10. ДГЭА используется для индуцирования СПКЯ у грызунов, повышая уровень тестостерона, соотношение ЛГ/ФСГ (лютеинизирующий гормон/фолликулостимулирующий гормон) и вызывая нерегулярные эстральные циклы¹¹. Эстрадиола валерат (ЭВ) является эстрогеном длительного действия, и исследования с использованием этого метода показывают, что уровни половых стероидных гормонов и гонадотропинов варьируются в зависимости от дозы вводимой ВВ 12,13,14. Летрозол является нестероидным ингибитором ароматазы¹⁵. Лечение летрозолом вызывает нециклическую течку, увеличивает массу яичников, массу тела, увеличивает адипоциты, максимизирует развитие фолликулов и повышает уровень тестостерона у крыс^16,17. У мышей, получавших летрозол, наблюдается повышенное количество синусовых фолликулов и геморрагических кист, а также повышенные концентрации ЛГ, ФСГ, эстрадиола и прогестерона^18,19.

В настоящее время основными методами моделирования СПКЯ, индуцированного летрозолом, являются пероральное введение и подкожное введение, оба из которых требуют повторного ежедневного введения 20,21,22. Эти методы требуют много времени и труда, а повторное введение, вероятно, вызывает значительный стресс^{у животных.} Хотя в некоторых исследованиях используются гранулы летрозола^24,25, эти продукты нуждаются в индивидуальной настройке и стоят дорого. В этом отчете описывается метод индуцирования СПКЯ у мышей с помощью мини-насосов. Этот метод прост, экономит время и использует хирургические инструменты и оборудование, которые легко доступны в большинстве лабораторий.

протокол

Все протоколы экспериментов на животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по этике животных Фуданьского университета. Здесь использовали самок мышей C57BL/6J в возрасте 4 недель. Подробная информация о животных, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка мини-насоса

1. Возьмите порошок летрозола (50 мг), хранящийся в оригинальной упаковке, центрифугируйте порошок летрозола во флаконе при 300 х г в течение 5 с (при комнатной температуре), затем откройте крышку.
2. Медленно добавьте 625 мкл ДМСО в порошок летрозола с помощью пипетки и хорошо перемешайте до получения исходного раствора в концентрации 8 мг/100 мкл, итого 625 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете другой размер упаковки порошка летрозола, пожалуйста, заранее рассчитайте необходимый объем ДМСО для настройки исходного раствора. Порошок летрозола, ДМСО и другие родственные соединения должны быть стерильными. Наконечники для пипеток, трубки и другие связанные с ними предметы должны быть стерильны или стерилизованы перед использованием.
3. Подсчитайте необходимое количество мышей в соответствии с планом эксперимента.
4. Наберите общее необходимое количество исходного раствора летрозола с помощью пипетки, в зависимости от необходимого количества мышей, и медленно вводите его в центрифужную пробирку.
   Примечание: 4-недельные мыши для 8-недельного воздействия были отобраны для индуцирования модели мышей с СПКЯ. Общая доза летрозола составляет 8 мг на каждую мышь, что требует имплантации двух последовательных насосов (один насос высвобождается в течение 4 недель), т.е. 4 мг/4 недели на каждый насос. Как упоминалось на шаге 1.2, концентрация исходного раствора летрозола составляет 8 мг/100 мкл. Для приготовления насосов требуется 50 μL исходного раствора для каждого насоса, как указано ниже: всего 4 мг летрозола, разделенное на 8 мг/100 μл.
5. Наберите равное количество PEG300, добавьте его в раствор летрозола и хорошо перемешайте (его можно соответствующим образом нагнетать).
6. Приготовьте раствор управляющей машины для контрольной группы (50 мкл ДМСО + 50 мкл PEG300 для каждого насоса без летрозола).
7. Подготовьте достаточное количество стерильных центрифужных пробирок в соответствии с требуемым количеством насосов; для каждого насоса необходимо подготовить одну центрифужную пробирку объемом 15 мл.
8. Наберите физиологический раствор с помощью шприца и добавьте 5 мл физиологического раствора в каждую центрифужную пробирку. Затем закройте пробирки центрифуги крышками и поместите их на штатив для пробирок для дальнейшего использования.
9. Наденьте новую пару стерильных перчаток, достаньте мини-помпы в нужном количестве и положите их на чистую стерильную столешницу или контейнер.
10. Большим и указательным пальцами аккуратно зажмите колпачок, который соответствует корпусу насоса, а другой рукой держите корпус насоса.
11. Медленно несколько раз проткните заливное отверстие насоса с помощью тонкой трубки, прикрепленной к колпачку (Рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкость не прочищена, она не может свободно течь в трубке после наполнения.
12. Возьмите иглу, подходящую к помпе, и стерильный шприц объемом 1 мл. Приложите иглу к шприцу и плотно затяните ее (рисунок 1В).
13. Осторожно и медленно наберите окончательный раствор летрозола, настроенный выше, с помощью только что собранного шприца (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация раствора летрозола должна производиться медленно и равномерно. При быстрой аспирации могут образовываться пузырьки воздуха, что может повлиять на последующее введение раствора препарата.
14. Введите раствор летрозола в мини-помпу.
    1. Одной рукой аккуратно зажмите мини-помпу так, чтобы она стояла вертикально, а другой рукой придерживайте вышеупомянутый шприц объемом 1 мл и медленно введите его в самое дно помпы (рисунок 1Е).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла не вставлена в нижнюю часть насоса, жидкость в насосе может легко пузыриться во время инъекции, что повлияет на последующий выброс препарата насосом.
    2. Затем медленно внедряйте настроенный раствор; Инъекцию можно заметить, когда отверстие насоса слегка пузырится.
    3. Вводите медленнее, когда объем инъекции приближается к 90 μл. Когда насос будет полностью заполнен (около 100 мкл), извлеките шприц.
    4. Аккуратно вставьте колпачок в корпус насоса и плотно затяните его; В этот момент выльется небольшое количество раствора. Тщательно сотрите его.
15. Возьмите насос, загруженный препаратом, выходным отверстием вверх (конец с крышкой), возьмите заранее подготовленную центрифужную пробирку, и полностью погрузите насос в стерильный физиологический раствор (рисунок 1F). Затем закройте пробирку центрифуги крышкой и поместите ее на штатив для пробирок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не загрязнить насос на протяжении всего процесса.
16. После того, как все мини-насосы будут изготовлены, поместите все центрифужные пробирки в термостат с температурой 37 °C на 48 часов.

2. Подготовка к операции и обезболивание

1. Подготовьте и простерилизуйте все необходимые инструменты в день операции, включая щипцы, гемостатики, хирургические ножницы, иглодержатели и рассасывающиеся хирургические шовные материалы 4-0.
2. Перед использованием аппарата для анестезии изофлураном (рис. 2B) тщательно проверьте правильность подключения трубопровода и убедитесь, что трубопровод не поврежден и не протекает.
3. Открутите уплотнительный колпачок на испарителе наркозного аппарата, затем медленно добавьте анестетик.
4. Держите уровень анестезии между верхним и нижним пределами, указанными на наркозном аппарате.
5. Преобразуйте трехходовой переключатель клапана, чтобы поток воздуха из испарителя анестезиологического аппарата был подключен к индукционной коробке для анестезии.
6. Откройте воздушный насос и испаритель, затем отрегулируйте концентрацию изофлурана для индукции анестезии (обычно 3%-4%).
7. Подождите около 1 минуты, пока анестетик заполнит индукционную коробку, затем поместите мышь в индукционную коробку и дождитесь полной анестезии (этот процесс занимает около 2-3 минут).
8. Убедитесь, что мыши адекватно обезболиваются, осторожно наклонив коробку. Если мыши перевернуты и не проявляют никаких признаков возвращения в лежачее положение, вводится анестезия.

3. Имплантация мини-помпы для летрозола

1. Наденьте хирургическую маску и стерильные перчатки.
2. Извлеките предварительно обезболенных мышей из индукционной коробки и нанесите крем для депиляции на спину мышей, затем подождите 1 минуту. Аккуратно сотрите крем для депиляции и волосы влажной марлей.
3. В то же время измените трехходовой переключатель клапанов, чтобы убедиться, что поток воздуха из испарителя анестезиологического аппарата подключен к маске для анестезии, и отрегулируйте поддерживающую концентрацию (обычно 2%).
4. После удаления волос возьмите мышь доминирующей рукой и поместите ее голову/нос в маску для анестезии.
5. Проверьте глубину анестезии, проверив рефлекс отвода педали.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с анестезией, должны выполняться с использованием газовых фильтров с таблетками активированного угля, а также в вытяжном шкафу.
6. Закрепите мышь в положении лежа на операционной пластине и нанесите смазку для глаз на оба глаза.
7. Нанесите тампоны с повидон-йодом три раза на открытые участки кожи (рисунок 2В). Затем подкожно вводят мелоксикам в дозе 2 мг/кг.
8. Подтвердите глубину анестезии, снова ущипнув палец ноги. Затем по средней линии задней части шеи, отдавая предпочтение коже на безволосой стороне, подхватите кожу щипцами и сделайте разрез примерно на 0,5 см в поперечном направлении с помощью скальпеля или хирургических ножниц (рисунок 2D).
9. Затем откройте эпидермис под разрезом и получите доступ к нему с помощью гемостата или иглодержателя, чтобы освободить кожу, освободив место для мини-помпы (примерно в 2 см от разреза) (рис. 2E).
10. Извлеките насос из физиологического раствора в центрифужной трубке с помощью стерильных щипцов открытым концом насоса вниз и будьте готовы ввести насос подкожно мышам (рисунок 2F).
11. Зажмите щипцами одну сторону разреза кожи и протолкните помпу в подкожное пространство. При входе в насос не должно быть сопротивления. Оказавшись внутри, пальцами слегка и осторожно сожмите насос внутрь как можно дальше (Рисунок 1G).
12. Аккуратно сшить место разреза с помощью хирургических швов 4-0 (рисунок 2H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить корпус подкожной помпы при наложении швов.
13. После наложения швов дважды продезинфицируйте кожу в месте операции йодофорными тампонами.

4. Восстановление животных

1. После операции аккуратно переложите мышей с матраса, используемого во время анестезии, на сухой чистый матрас. Убедитесь, что мыши находятся в теплой и тихой среде.
2. Внимательно следите за состоянием мышей, например, за глубиной и частотой их дыхания.
3. Наблюдайте за поведением мышей, когда их подвижность начинает возвращаться. Наконец, убедитесь, что они могут стоять и ходить без каких-либо очевидных отклонений от нормы, таких как головокружение или нескоординированные движения.
4. После того как мыши выздоровеют, аккуратно переложите их в заранее подготовленные клетки. Поместите стерильное желе и корм на дно клетки, чтобы мыши могли питаться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растяжение места операции может помешать мышам легко пить и есть в течение раннего послеоперационного периода, поэтому кладите желе и пищу на дно клетки.
5. Вводить мелоксикам подкожно в дозе 2 мг/кг (каждые 24 ч в течение первых 3 дней после операции). После 8 недель лечения летрозолом (т.е. двух последовательных имплантаций мини-помпы) протестируйте модели мышей.

Результаты

Протокол эксперимента и некоторые критические шаги показаны на рисунках 1 и 2. Уровни тестостерона в сыворотке крови показаны на рисунке 3А. У мышей, получавших лечение мини-помпой Летрозола (далее именуемых мышами LTZ), на...

Обсуждение

В этом отчете демонстрируется простой протокол для индуцирования СПКЯ у мышей с использованием легкодоступных материалов. Мышиная модель СПКЯ имеет важное значение для изучения механизмов СПКЯ и скрининга лекарственных препаратов²⁶. Из доступных метод?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syringe	Bofeng Biotech	BD300841	1ML (sterile)
Centrifugation tube	Biological Hope	1850-K	15ML (sterile)
Pipette	Eppendorf	3123000268-A	100μL-1000μL (sterile)
Pipette	TopPette	7010101008	10μL-100μL (sterile)
Letrozole powder	Sigma	L6545-50MG	Primary acting drugs (sterile)
PEG(Poly(ethylene glycol))	Solarbio	P8250	Used for dissolution (sterile)
Sterile Physiological Saline Solution	Biosharp	BL158A	Mini-pump storage
Osmotic Pumps	ALZET	1004	Letrozole storage and sustained release (sterile)
Dimethyl sulfoxide	Biosharp	BS087	Used for dissolution (sterile)
Small Animal Anesthesia Machine	RWD	R500IP	Used for anesthesia
Isoflurane	RWD	20071302	Used for anesthesia
Hemostats	Biosharp	BS-HF-S-125	Surgical instrument
Scissors	Biosharp	BS-SOR-S-100P	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32010	Surgical instrument
Forceps	RWD	F12028	Surgical instrument
Needle and the 4-0 absorbable suture	JINGHUAN	CR413	Surgical instrument
Povidone-iodine swabs	SingleLady	GB26368-2010	Skin disinfection
Depilatory cream	ZIKER BIOTECHNOLOGY	ZK-L2701	Depilation agent for laboratory animals
Nitrile Gloves	Biosharp	BC040-L	Used for aseptic operation
Sterile gauze	ZHENDE	BA69087	Used for wiping liquids
C57BL/6J Mice	Shanghai Model Organisms Center	N/A	Age: 4 weeks
Pet Eye Lubricant	BAITE	SHF021153	Used for mouse eye lubricant
Meloxicam Injection	MEIDAJIA	R21064-21	Used for mouse analgesia (sterile)