Une technique modifiée pour induire le syndrome des ovaires polykystiques chez la souris

Résumé

Ce protocole introduit une technique permettant d’induire des modèles de syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez la souris par une libération contrôlée de létrozole à l’aide de mini-pompes. Sous anesthésie adéquate, la mini-pompe a été implantée par voie sous-cutanée et le SOPK a été induit avec succès chez les souris après une certaine période de libération de la mini-pompe.

Résumé

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est l’une des principales causes d’infertilité chez les femmes. Les modèles animaux sont largement utilisés pour étudier les mécanismes étiologiques du SOPK et pour le développement de médicaments connexes. Des modèles murins induits par le létrozole reproduisent les phénotypes métaboliques et reproductifs des patients atteints du SOPK. La méthode traditionnelle de traitement au létrozole chez les souris SOPK nécessite un dosage quotidien sur une certaine période, ce qui peut demander beaucoup de main-d’œuvre et causer un stress important aux souris. Cette étude décrit une méthode simple et efficace pour induire le SOPK chez la souris en implantant une mini-pompe contrôlée libérant du létrozole. Une mini-pompe capable de libérer de manière stable et continue une quantité quantitative de létrozole a été fabriquée et implantée par voie sous-cutanée chez des souris sous anesthésie. Cette étude a démontré que le modèle murin imitait avec succès les caractéristiques du SOPK après l’implantation d’une mini-pompe au létrozole. Les matériaux et l’équipement utilisés dans cette étude sont facilement disponibles pour la plupart des laboratoires, ne nécessitant aucune personnalisation particulière. Collectivement, cet article fournit une méthode unique et facile à mettre en œuvre pour induire le SOPK chez la souris.

Introduction

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est l’une des affections les plus courantes chez les femmes en âge de procréer¹. Il touche jusqu’à 18 % des femmes dans le monde et est la principale cause d’infertilité féminine dans le monde ^2,3. Le SOPK se caractérise par une série d’anomalies reproductives interdépendantes, notamment une sécrétion de gonadotrophine perturbée, une anovulation chronique, une augmentation de la production d’androgènes et une morphologie ovarienne polykystique⁴. En plus des troubles gynécologiques, le SOPK augmente également le risque de maladies cardiovasculaires ^5,6. Malgré des décennies de recherche, l’étiologie du SOPK reste incertaine ^7,8.

Pour mieux comprendre la pathogenèse du SOPK et développer de nouvelles thérapies, la création de modèles animaux qui imitent étroitement la physiologie humaine est d’une importance capitale⁹. Les modèles de SOPK chez les rongeurs actuellement rapportés comprennent ceux induits par des traitements à base de testostérone, de létrozole et de valérate d’œstradiol, entre autres. La testostérone induit une hyperandrogénémie et est plus couramment utilisée comme inducteur du SOPK chez le rat¹⁰. La DHEA a été utilisée pour induire le SOPK chez les rongeurs, augmentant les niveaux de testostérone, les rapports LH/FSH (hormone lutéinisante/hormone folliculo-stimulante) et provoquant des cycles œstraux irréguliers¹¹. Le valérate d’œstradiol (VE) est un œstrogène à action prolongée, et des études utilisant cette méthode montrent que les niveaux d’hormones stéroïdes sexuelles et de gonadotrophines varient en fonction de la dose de VE administrée 12,13,14. Le létrozole est un inhibiteur non stéroïdien^{de l’aromatase 15}. Le traitement au létrozole induit un œstrus non cyclique, augmente le poids ovarien, le poids corporel, agrandit les adipocytes, maximise le développement des follicules et augmente les niveaux de testostérone chez les rats^16,17. Les souris traitées au létrozole présentent un nombre accru de follicules sinusaux et de kystes hémorragiques, ainsi que des concentrations élevées de LH, de FSH, d’œstradiol et de progestérone^18,19.

À l’heure actuelle, les principales méthodes de modélisation du SOPK induit par le létrozole impliquent l’administration orale et l’injection sous-cutanée, qui nécessitent toutes deux des doses quotidiennes répétées 20,21,22. Ces méthodes prennent du temps et demandent beaucoup de main-d’œuvre, et l’administration répétitive est susceptible de causer un stress important aux animaux²³. Bien que certaines études utilisent des granulés de létrozole^24,25, ces produits doivent être personnalisés et sont coûteux. Ce rapport décrit une technique permettant d’induire le SOPK chez la souris à l’aide de mini-pompes. Cette méthode est simple, permet de gagner du temps et utilise des outils et des équipements chirurgicaux facilement disponibles dans la plupart des laboratoires.

Protocole

Tous les protocoles d’expérimentation animale de cette étude ont été approuvés par le Comité d’éthique animale de l’Université Fudan. Des souris femelles C57BL/6J, âgées de 4 semaines, ont été utilisées ici. Les détails des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation de la mini-pompe

1. Prenez la poudre de létrozole (50 mg) stockée dans le flacon d’emballage d’origine, centrifugez la poudre de létrozole dans le flacon à 300 x g pendant 5 s (à température ambiante), puis ouvrez le bouchon.
2. Ajouter lentement 625 μL de DMSO à la poudre de létrozole à l’aide d’une pipette et bien mélanger pour obtenir une solution mère à une concentration de 8 mg/100 μL, soit un total de 625 μL.
   REMARQUE : Si vous utilisez un emballage différent de poudre de létrozole, veuillez calculer le volume requis de DMSO à l’avance pour configurer la solution mère. La poudre de létrozole, le DMSO et les autres composés apparentés doivent être de qualité stérile. Les pointes de pipette, les tubes et autres articles connexes doivent être stériles ou stérilisés avant utilisation.
3. Comptez le nombre de souris requises selon le plan d’expérience.
4. Prélevez la quantité totale de solution mère de létrozole nécessaire à l’aide d’une pipette, en fonction du nombre de souris requises, et injectez-la lentement dans le tube à centrifuger.
   REMARQUE : Des souris âgées de 4 semaines pour une exposition de 8 semaines ont été sélectionnées pour induire le modèle de souris SOPK. La dose totale de létrozole est de 8 mg pour chaque souris, ce qui nécessite l’implantation de deux pompes consécutives (une pompe se libère pendant 4 semaines), soit 4 mg/4 semaines par pompe. Comme mentionné à l’étape 1.2, la concentration de la solution mère de létrozole est de 8 mg/100 μL. Pour préparer les pompes, il faut 50 μL de solution mère pour chaque pompe, comme calculé ci-dessous : un total de 4 mg de létrozole divisé par 8 mg/100 μL.
5. Prélevez une quantité égale de PEG300, ajoutez-le à la solution de létrozole et mélangez bien (il peut être vortex de manière appropriée).
6. Préparez la solution du véhicule de contrôle pour le groupe témoin (50 μL de DMSO + 50 μL de PEG300 pour chaque pompe sans létrozole).
7. Préparer un nombre adéquat de tubes à centrifuger stériles en fonction du nombre de pompes nécessaires ; un tube à centrifuger de 15 ml doit être préparé pour chaque pompe.
8. Prélevez une solution saline à l’aide d’une seringue et ajoutez 5 ml de solution saline dans chaque tube à centrifuger. Ensuite, bouchez les tubes à centrifuger et placez-les sur un support de tubes pour une utilisation ultérieure.
9. Portez une nouvelle paire de gants stériles, sortez les mini-pompes dans la quantité souhaitée et placez-les sur un comptoir ou un récipient propre et stérile.
10. Pincez doucement le capuchon qui correspond au corps de la pompe avec le pouce et l’index, et tenez le corps de la pompe avec l’autre main.
11. Enfoncez lentement l’orifice de remplissage de la pompe à plusieurs reprises avec le tube mince fixé au capuchon (Figure 1B).
    REMARQUE : S’il n’est pas débouché, le liquide peut ne pas s’écouler librement dans le tube après le remplissage.
12. Prenez l’aiguille qui correspond à la pompe et une seringue stérile de 1 ml. Fixez l’aiguille à la seringue et serrez-la (Figure 1C).
13. Prélevez soigneusement et lentement la solution finale de létrozole configurée ci-dessus avec la seringue nouvellement assemblée (Figure 1D).
    REMARQUE : L’aspiration de la solution de létrozole doit être effectuée lentement et uniformément. L’aspiration rapide peut générer des bulles d’air, ce qui peut affecter l’injection ultérieure de la solution médicamenteuse.
14. Injectez la solution de létrozole dans la mini-pompe.
    1. Pincez soigneusement une mini-pompe d’une main pour qu’elle se tienne debout, et de l’autre main, tenez la seringue de 1 ml susmentionnée et insérez-la lentement dans le bas de la pompe (Figure 1E).
       REMARQUE : Si l’aiguille n’est pas insérée dans le bas de la pompe, le liquide dans la pompe peut facilement bouillonner pendant l’injection, ce qui affectera la libération ultérieure du médicament par la pompe.
    2. Ensuite, injectez lentement la solution configurée ; L’injection peut être constatée lorsque l’ouverture de la pompe fait légèrement des bulles.
    3. Injecter plus lentement lorsque le volume d’injection approche 90 μL. Une fois la pompe complètement remplie (environ 100 μL), retirez la seringue.
    4. Insérez soigneusement le capuchon dans le corps de la pompe et serrez-le ; À ce stade, une petite quantité de solution se répandra. Essuyez-le soigneusement.
15. Prenez la pompe chargée du médicament, avec la sortie vers le haut (l’extrémité avec le bouchon), prenez le tube à centrifuger préalablement préparé et immergez complètement la pompe dans une solution saline stérile (Figure 1F). Ensuite, bouchez le tube de centrifugation et placez-le sur le support de tubes.
    REMARQUE : Veillez à ne pas contaminer la pompe tout au long du processus.
16. Une fois toutes les mini-pompes fabriquées, placez tous les tubes de centrifugation dans un thermostat à 37 °C pendant 48 h.

2. Préparation à l’opération et à l’anesthésie

1. Préparez et stérilisez tous les instruments requis le jour de l’opération, y compris les forceps, les hémostats, les ciseaux chirurgicaux, les porte-aiguilles et les sutures chirurgicales résorbables 4-0.
2. Avant d’utiliser l’appareil d’anesthésie à l’isoflurane (Figure 2B), vérifiez soigneusement si le raccord du pipeline est correct et assurez-vous que le pipeline est intact et qu’il ne fuit pas.
3. Dévissez le bouchon d’étanchéité de remplissage au niveau de l’évaporateur de l’appareil d’anesthésie, puis ajoutez lentement l’anesthésique.
4. Maintenez le niveau d’anesthésique entre les limites supérieure et inférieure indiquées sur l’appareil d’anesthésie.
5. Convertissez l’interrupteur de la vanne à trois voies pour vous assurer que le flux d’air de l’évaporateur de l’appareil d’anesthésie est connecté au boîtier d’induction de l’anesthésie.
6. Ouvrez la pompe à air et l’évaporateur, puis ajustez la concentration d’isoflurane pour l’induction de l’anesthésie (généralement 3%-4%).
7. Attendez environ 1 minute jusqu’à ce que l’anesthésique remplisse la boîte d’induction, puis placez la souris dans la boîte d’induction et attendez jusqu’à ce que l’anesthésie soit complète (ce processus prend environ 2-3 min).
8. Vérifiez que les souris sont correctement anesthésiées en basculant doucement la boîte. Si les souris sont retournées et ne montrent aucun signe de retour en position couchée, une anesthésie est induite.

3. Implantation de la mini-pompe à létrozole

1. Mettez un masque chirurgical et des gants stériles.
2. Retirez les souris pré-anesthésiées de la boîte d’induction et appliquez la crème dépilatoire sur le dos des souris, puis attendez 1 min. Essuyez délicatement la crème dépilatoire et les cheveux avec de la gaze humide.
3. Dans le même temps, changez l’interrupteur de la vanne à trois voies pour vous assurer que le flux d’air de l’évaporateur de l’appareil d’anesthésie est connecté au masque d’anesthésie et ajustez la concentration de maintien (généralement 2 %).
4. Après l’épilage, tenez la souris avec la main dominante et placez sa tête/son nez dans le masque d’anesthésie.
5. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en testant le réflexe de retrait de la pédale.
   REMARQUE : Toutes les procédures impliquant une anesthésie doivent être effectuées à l’aide de filtres à gaz équipés de pastilles de charbon actif, et la procédure doit être effectuée dans une hotte.
6. Fixez la souris en position couchée sur la plaque de commande et appliquez du lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux.
7. Appliquez trois fois des tampons de povidone iodée sur la peau exposée (figure 2C). Ensuite, injectez du méloxicam par voie sous-cutanée à une dose de 2 mg/kg.
8. Confirmez à nouveau la profondeur de l’anesthésique par un pincement des orteils. Ensuite, sur la ligne médiane de la nuque, en favorisant la peau du côté glabre, prélevez la peau avec une pince et faites une incision latérale d’environ 0,5 cm avec un scalpel ou des ciseaux chirurgicaux (Figure 2D).
9. Ouvrez ensuite l’épiderme sous l’incision et accédez-y à l’aide d’un hémostat ou d’un porte-aiguille pour libérer la peau, laissant place à une mini-pompe (à environ 2 cm de l’incision) (Figure 2E).
10. Retirez la pompe de la solution saline dans le tube à centrifuger à l’aide d’une pince stérile, l’extrémité ouverte de la pompe vers le bas, et soyez prêt à insérer la pompe par voie sous-cutanée dans les souris (Figure 2F).
11. Clampez un côté de l’incision cutanée à l’aide d’une pince et enfoncez la pompe dans l’espace sous-cutané. Il ne doit y avoir aucune résistance lors de l’entrée dans la pompe. Une fois à l’intérieur, utilisez les doigts pour presser légèrement et doucement la pompe vers l’intérieur aussi loin que possible (Figure 1G).
12. Suturez soigneusement le site de l’incision à l’aide de sutures chirurgicales 4-0 (Figure 2H).
    REMARQUE : Veillez à ne pas endommager le corps de la pompe sous-cutanée lors de la suture.
13. Après la suture, désinfectez la peau du site chirurgical à deux reprises avec des écouvillons d’iodophore.

4. Récupération des animaux

1. Après la chirurgie, transférez doucement les souris du matelas utilisé pendant l’anesthésie vers un matelas sec et propre. Assurez-vous que les souris sont dans un environnement chaud et calme.
2. Surveillez de près l’état des souris, comme la profondeur et la fréquence de leur respiration.
3. Observez le comportement des souris lorsque leur mobilité commence à revenir. Enfin, assurez-vous qu’ils peuvent se tenir debout et marcher sans comportements anormaux évidents tels que des étourdissements ou des mouvements non coordonnés.
4. Une fois que les souris se sont rétablies, transférez-les doucement dans des cages préparées. Placez de la gelée stérile et de la nourriture au fond de la cage pour que les souris puissent se nourrir.
   REMARQUE : L’étirement du site chirurgical peut empêcher les souris de boire et de manger facilement pendant le début de la période postopératoire, alors placez de la gelée et de la nourriture au fond de la cage.
5. Injecter le méloxicam par voie sous-cutanée à la dose de 2 mg/kg (toutes les 24 h pendant les 3 premiers jours après la chirurgie). Après 8 semaines de traitement au létrozole (c’est-à-dire deux implantations consécutives de mini-pompe), testez les modèles de souris.

Résultats

Le protocole expérimental et certaines étapes critiques sont illustrés à la figure 1 et à la figure 2. Les taux sériques de testostérone sont affichés sur la figure 3A. Les souris traitées par mini-pompe au létrozole (ci-après appelées souris LTZ) ont présenté des taux de testostérone sérique significativement élevés par rapport aux souris témoins femelles. Pendant ce temps, l’a...

Discussion

Ce rapport fait la démonstration d’un protocole simple pour induire le SOPK chez la souris à l’aide de matériaux facilement accessibles. Le modèle murin du SOPK est essentiel pour explorer les mécanismes du SOPK et dépister les médicaments²⁶. Parmi les méthodes disponibles pour induire des modèles de SOPK chez la souris, l’induction du létrozole est l’une des plus couramment utilisées. L’utilisation du létrozole peut développer et maintenir ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syringe	Bofeng Biotech	BD300841	1ML (sterile)
Centrifugation tube	Biological Hope	1850-K	15ML (sterile)
Pipette	Eppendorf	3123000268-A	100μL-1000μL (sterile)
Pipette	TopPette	7010101008	10μL-100μL (sterile)
Letrozole powder	Sigma	L6545-50MG	Primary acting drugs (sterile)
PEG(Poly(ethylene glycol))	Solarbio	P8250	Used for dissolution (sterile)
Sterile Physiological Saline Solution	Biosharp	BL158A	Mini-pump storage
Osmotic Pumps	ALZET	1004	Letrozole storage and sustained release (sterile)
Dimethyl sulfoxide	Biosharp	BS087	Used for dissolution (sterile)
Small Animal Anesthesia Machine	RWD	R500IP	Used for anesthesia
Isoflurane	RWD	20071302	Used for anesthesia
Hemostats	Biosharp	BS-HF-S-125	Surgical instrument
Scissors	Biosharp	BS-SOR-S-100P	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32010	Surgical instrument
Forceps	RWD	F12028	Surgical instrument
Needle and the 4-0 absorbable suture	JINGHUAN	CR413	Surgical instrument
Povidone-iodine swabs	SingleLady	GB26368-2010	Skin disinfection
Depilatory cream	ZIKER BIOTECHNOLOGY	ZK-L2701	Depilation agent for laboratory animals
Nitrile Gloves	Biosharp	BC040-L	Used for aseptic operation
Sterile gauze	ZHENDE	BA69087	Used for wiping liquids
C57BL/6J Mice	Shanghai Model Organisms Center	N/A	Age: 4 weeks
Pet Eye Lubricant	BAITE	SHF021153	Used for mouse eye lubricant
Meloxicam Injection	MEIDAJIA	R21064-21	Used for mouse analgesia (sterile)