פיתוח גישה מבוססת מיקרופלואידיקה לחקר מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים

Summary

פרוטוקול זה מפרט את התכנון והייצור של מכשיר מיקרופלואידי, המתאים לחקירת מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים. הסינתזה של מיקרו-ייצור, בקרת זרימה אוטומטית וטכניקות מידול חישוביות מאפשרת מערכת גמישה המתאימה באופן אידיאלי לחקירת השלד התאי במבחנה.

Abstract

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את התכנון והייצור של מכשיר מיקרופלואידית שפותח לחקירת מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים. העיצוב מנצל את היתרונות המהותיים של התקנים מיקרופלואידיים מבוססי פולידימתילסילוקסן (PDMS) ומציג מספר תכונות כדי לאפשר גישה ניסיונית חזקה וניתנת להתאמה אישית בתפוקה גבוהה. המכשיר שפותח משלב יכולות לכידת בועות מיותרות כדי למנוע התרחשות של בועות אוויר מזיקות. יתר על כן, המכשיר מתממשק למערכת בקרת זרימה אוטומטית כדי להפחית התערבות ידנית ולאפשר ניתוחים בתפוקה גבוהה. תוכנת סימולציה מסחרית משמשת לפיתוח והבנה טובה יותר של הובלת הנוזלים באמצעות מערכת זו. לבסוף, אנו מדגימים את היכולת לבצע ניסויים מרובים בו זמנית בתוך מכשיר יחיד על ידי גידול הרחבות מיקרו-צינוריות עם תוויות פלואורסצנטיות מובהקות בחלקים שונים של המכשיר. בסך הכל, ניתן להשתמש במערכת זרימה מיקרופלואידית זו כדי לחקור את מכניקת הפולימר של מיקרו-צינוריות ומספקת שיפורים בתכנון ניסיוני למחקרי מיקרו-צינורות רחבים יותר במבחנה . הסינתזה של מיקרו-ייצור, בקרת זרימה אוטומטית וגישות מודלים חישוביים מאפשרת מערכת גמישה המתאימה באופן אידיאלי לחקירת השלד התאי במבחנה.

Introduction

מיקרופלואידיקה מאפשרת שליטה מדויקת בנפחי נוזלים זעירים, לרוב פחות ממיקרוליטר אחד, על ידי תכנון וייצור מורכבים של תעלות זרימת נוזלים ^1,2. קנה המידה הקטן של מכשירים מיקרופלואידיים מוליד תופעות הנדסיות ייחודיות. כלומר, מספר ריינולדס - מדד חסר מימד של היחס בין כוחות אינרציאלים וצמיגים בזרימת נוזלים - הוא קטן, בדרך כלל בסדר גודל של O(10) או נמוך יותר במיקרופלואידיקה, מה שמדגיש את החשיבות של כוחות צמיגים במכשירים מיקרופלואידיים. בנוסף, מספר Péclet, המשווה הסעה להובלה דיפוזית, מראה כי הובלת הסעה היא בדרך כלל זניחה במיקרופלואידיקה ^3,4,5. משטר זרימה למינרי מונע דיפוזיה זה במיקרופלואידיקה הוא יתרון, מכיוון שהוא תומך בניסויים מקבילים במכשיר יחיד על ידי שמירה על שיפועי נוזלים מדויקים.

פוטוליתוגרפיה נותרה השיטה העיקרית לייצור מכשירים מיקרופלואידיים ^6,7,8. בקצרה, תהליך זה כרוך ביצירת תבנית חרוטה 'מאסטר' של התכן המיקרופלואידי (איור 1). מכינים מצע רגיש לאור, ומסכת פוטו של העיצוב המיקרופלואידי חושפת באופן סלקטיבי אזורים של פוטו-רזיסט לקרינה אולטרה סגולה. שיטות תחריט עוקבות מפתחות את המצע, ומייצרות תבליט של העיצוב. פולידימתילסילוקסן (PDMS) נוצק לעתים קרובות ונרפא על המאסטר. ה-PDMS הנרפא, המאמץ את התכונות השליליות של העיצוב, מוסר לאחר מכן מהמאסטר ומודבק לכיסוי זכוכית. כל תהליך הייצור הזה אורך בדרך כלל 1-2 ימים, מה שמאפשר איטרציות עיצוב מהירות וייצור של מספר מכשירים. סקירות מפורטות של תהליכי ליתוגרפיה רכה ומיקרו-ייצור זמינות בהפניות אחרות 1,2,3,10,11,12,13.

איור 1: סקירה כללית של תהליך הפוטוליתוגרפיה המסורתי ותהליך המיקרו-ייצור. (A) תהליך פוטוליתוגרפיה מסורתי ו-(B) תהליך מיקרו-ייצור. בהתאם ליישום ולמאפייני הפוטו-התנגדות הרצויים, ניתן להשתמש בפוטו-רזיסט שלילי או חיובי, למרות שהם יניבו את אותו מאסטר עיצובי. מאפיינים כגון גובה תכונה רצוי או טמפרטורת התכה של פוטו-התנגדות עוזרים לקבוע את סוג הפוטו-התנגדות המתאים. נתון זה שונה באישור רוג'רס (2022)¹⁴. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

השימוש במיקרופלואידיקה הרחיב את האפשרויות בתחומי מחקר רבים, כאשר השפעתו האחרונה היא במדעי הביולוגיה. בהתחשב בקנה המידה הקטן שלה, מיקרופלואידיקה מאפשרת ניהול מדויק של משאבים מוגבלים ויקרי ערך כגון תאים או חלבונים. משפיעה עוד יותר היא יכולת הכוונון של מערכות מיקרופלואידיות לחקות תנאים פיזיולוגיים, כגון שינויים בנוקשות המצע, הפעלת כוח על דגימה ואפילו שילוב זרם חשמלי. בנוסף, השימוש במיקרופלואידיקה מציע את היכולת לתפעל מספר ריאגנטים במקביל וליצור במהירות אב-טיפוס ולחדד באופן איטרטיבי עיצובי מערכת. תכונות אלה מאפשרות מזעור של זרימות עבודה שלמות במעבדה למכשיר יחיד, המכונה בדרך כלל "מעבדה על שבב^"1,6,9,15,16,17,18,19.

אחד היישומים התאיים-ביולוגיים של מיקרופלואידיקה הוא חקירת פולימרים מיקרו-צינוריים. מיקרו-צינורות הם מרכיב חיוני בשלד התא, וממלאים תפקיד חיוני בתהליכים כמו חלוקת תאים והובלת מטען תוך תאי^20,21. כאלמנט הנוקשה ביותר של השלד הציטוטי, מיקרו-צינורות מציגים מודול אלסטי הדומה לזה של פרספקס^22,23. התכונות המכניות החזקות שלהם חיוניות לתפקודים תאיים שונים, כולל, למשל, התכווצות קרדיומיוציטים, שם הם מתכופפים ונרגעים באופן מחזורי במהלך השלבים הסיסטוליים והדיאסטוליים של הלב²⁴. מכשירים מיקרופלואידיים אומצו בעבר כדי לחקור את המאפיינים של מיקרו-צינורות ואת המבנים שלהם מסדר גבוה יותר במבחנה. ואכן, מיקרופלואידיקה שימשה כדי לחקור דינמיקת פילמור מיקרו-צינורית, אינטראקציות מיקרו-צינוריות-מיקרו-צינוריות וההשפעות של חלבונים הקשורים למיקרו-צינוריות על התכונות המכניות של מיקרו-צינוריות 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ^,36,37,38,39,40,41.

בעוד שהכנסת מיקרופלואידיקה לתחום המיקרו-צינוריות הביאה לתגליות מרגשות רבות, עדיין טמון מקום לשיפור בהתאמה של מכשירים אלה למחקר מיקרו-צינוריות. בעבודה זו, אנו מתייחסים לשתי מגבלות ספציפיות המתמשכות בחקר מיקרו-צינורות במכשירים מיקרופלואידיים: הפוטנציאל להיווצרות בועות אוויר בתוך המכשיר, המוצג בדרך כלל על ידי מניפולציה ידנית של התקנים מיקרופלואידיים, וניצול חסר של מבחנים בעלי תפוקה גבוהה. ראשית, מניפולציות ידניות, כגון חיבור וניתוק צינורות, יכולות להכניס היווצרות בועות לערוצים. היווצרות בועות אוויר בתוך תא זרימה היא קטסטרופלית, שכן בועות אוויר עלולות לפגוע בחלבונים, לגזור פולימרים מיקרו-צינוריים ולהשפיע לרעה על תרביות תאים^42,43. בנוסף, פינות חדות וזוויות אלכסוניות במכשיר גורמות להרטבת משטח לא אחידה, מה שמגדיל את האפשרות של כניסת אוויר. טכניקות רבות פותחו כדי להפחית את היווצרותן, התמדה וההשפעה של בועות אוויר; עם זאת, השימוש בשיטות להפחתת בועות אינו אוניברסלי 42,43,44,45,46. יתר על כן, למרות שאחד היתרונות העיקריים של שימוש במיקרופלואידיקה הוא היכולת של ניסויים בתפוקה גבוהה, מיקרופלואידיקה עדיין לא שימשה להגדלת מחקר המיקרו-צינורות. ניתן לתכנן התקנים מיקרופלואידיים לבדיקת תנאי ניסוי מרובים במקביל באותו מכשיר. לדוגמה, ניתן להשתמש בשיפועי נוזלים כדי לכוון את הזרימה של חלבונים או תרופות שונות הקשורות למיקרו-צינוריות, מה שמאפשר את מסירתם הממוקדת לאזורים ספציפיים של מיקרו-צינורות מחולקים בתוך אותו מכשיר.

כאן, עיצבנו באופן איטרטיבי מכשיר מיקרופלואידי הנותן מענה למגבלות אלה. אנו מספקים את הפרוטוקול שלב אחר שלב של ייצור המכשיר, ובכך מאפשרים לקהל רחב יותר להשתמש בטכנולוגיה מיקרופלואידית במחקר המיקרו-צינוריות שלהם. עיצוב מכשיר זה משלב תכונות לכידת בועות ומשתמש במערכת בקרת זרימה אוטומטית כדי להפחית את ההתערבות הידנית תוך מתן אפשרות לשיפועי פתרונות במכשיר לניתוחים בתפוקה גבוהה. לסיכום, הפיתוח של עיצוב מיקרופלואידי זה יכול להקל על מחקר והבנה רחבים יותר של מכניקת המיקרו-צינוריות תוך הצעת שיפורים יקרי ערך לעיצובים ניסיוניים בתחום המחקר הרחב יותר של מיקרו-צינוריות.

Protocol

הערה: העבודה המפורטת בחלק זה של הפרוטוקול בוצעה בחדר הנקי של מכון ונדרבילט למדע והנדסה בקנה מידה ננומטרי (VINSE). רצוי חדר נקי מבוקר עם חלוק מתאים ותאורה מסוננת UV כדי למנוע נזק למכשיר עקב תנאי לחות/תאורת סביבה ולמנוע זיהום חלקיקים. כל המניפולציות על פרוסות סיליקון צריכות להיעשות כשהצד המלוטש של פרוסת הסיליקון פונה כלפי מעלה. השתמש בפינצטה בעת מניפולציה של פרוסות ומזער את המגע במשטחי הפרוסה כדי למנוע שריטות. שמור ופלים בצלחות פטרי כשהמכסים מכוסים בעת ההובלה ובסוף כל יום אלא אם כן הוראה אחרת.

1. פוטוליתוגרפיה (6 - 8 שעות)

1. נקה פלזמה פרוסת סיליקון בגודל 3 אינץ' למשך 5 דקות בוואקום (באופן אידיאלי, לחץ ואקום < 5 ^{× 10-5} טור) באמצעות פלזמת חמצן (O₂) או אוויר יבש נקי (CDA).
2. מרכז את פרוסת הסיליקון על ציפוי מסתובב לתצהיר של הפוטו-רזיסט.
3. הפקידו ~1-2 מ"ל של SPR 220 7.0 photoresist על מרכז פרוסת הסיליקון.
   זהירות: טפל בפוטו-רזיסט עם כפפות והגנה על העיניים והשליך בהתאם לפרוטוקולים הספציפיים ליצרן/אתר.
4. ציפוי סובב את הפוטו-רזיסט על פרוסת הסיליקון לעובי הרצוי בהתבסס על עקומות הסיבוב של היצרן. צור שכבות בעובי ~13 מיקרומטר על ידי סיבוב ב-1000 סל"ד למשך 30 שניות. מאוחר יותר, נקה את שאריות הפוטו-רזיסט על ציפוי הסיבוב עם אצטון והשליכו אותו לפי פרוטוקולים ספציפיים לאתר.
   הערה: אם לאחר ציפוי הסיבוב, הוופל אינו מצופה באופן אחיד בפוטו-רזיסט, חזור על שלבים 1.2-1.4. ציפוי לא אחיד יכול לנבוע מפרוסת לא מרוכזת על ציפוי הספין, שימוש במעט מדי התנגדות לאור ו/או אי הפקדת הפוטו-רזיסט על מרכז הוופל.
5. תוך נגיעה מועטה ככל האפשר בפוטו-רזיסט על הוופל, העבירו את פרוסת הסיליקון לפלטה חמה המוגדרת ב-70 מעלות צלזיוס.
6. דגרו את פרוסת הסיליקון על הפלטה החמה, והעלו את הטמפרטורה ב-10 מעלות צלזיוס כל 3-5 דקות עד שהטמפרטורה מגיעה ל-115 מעלות צלזיוס.
7. כבה את הפלטה החמה ואפשר לפרוסת הסיליקון להתקרר עד שהטמפרטורה שלה נמוכה מ-65 מעלות צלזיוס.
   הערה: שלבי החימום והקירור מבוצעים לאט כדי למנוע סדקים תרמיים של הפוטו-רזיסט, הנפוץ בעובי זה. אם אכן מתרחשים סדקים תרמיים, בדרך כלל ניתן לתקן אותם על ידי חימום מחדש של פרוסת הסיליקון והאטת קצב הקירור.
8. בעזרת מלקחיים, העבירו את פרוסת הסיליקון המקוררת ליישור מסכה וטענו גם את פרוסת הסיליקון וגם את מסיכת הפוטו המתאימה ליישור המסכה בהתאם לפרוטוקולים הספציפיים ליצרן/לאתר.
   הערה: מסכות צילום יוצרו על ידי גורם חיצוני תוך שימוש בעיצוב מוגדר, שנוצר עם AutoCAD. ראו קובץ משלים 1 לעיבוד עיצוב המסיכה.
9. חשוף את פרוסת הסיליקון לקרינה אולטרה סגולה (UV) לזמן מסוים (בהתבסס על עוצמת מנורת ה-UV) בהתאם לפרוטוקולים הספציפיים ליצרן/אתר. האנרגיה הרצויה ליישום זה היא ~400 mJ/cm², וחשב את זמן החשיפה לפי הנוסחה: .
10. לאחר החשיפה, הסר את פרוסת הסיליקון מיישור המסכה ואפשר לפוטו-רזיסט להתייבש למשך 4 שעות על ידי זרימת אוויר. ודא שמכסה צלחת הפטרי נשאר סגור כדי לאפשר זרימת אוויר, אך הנח את המנה באזור שסביר להניח שלא יהיה חשוף לחלקיקים.
    הערה: ניתן לקחת הפסקה של 4 שעות במהלך זמן ההתייבשות הזה, אך מומלץ להמשיך בהליך באותו היום.
11. לאחר ההתייבשות של 4 שעות, העבירו את הוופל החשוף לפלטה חמה המוגדרת על 70 מעלות צלזיוס.
12. דגרו את פרוסת הסיליקון על הפלטה החמה, והעלו את הטמפרטורה ב-10 מעלות צלזיוס כל 3-5 דקות עד שהטמפרטורה מגיעה ל-115 מעלות צלזיוס.
13. הניחו לוופל לדגור בטמפרטורה של 115 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
14. צור 'כיסוי' מבודד לפרוסה החשופה על ידי יציקת יריעת נייר אלומיניום בצורת מכסה צלחת פטרי.
15. כבה את הפלטה החמה וכסה את הוופל החשוף במכסה נייר האלומיניום. הניחו לוופל להתקרר באופן סביבתי למשך הלילה.
    הערה: פיצוח תרמי של הפוטו-רזיסט נפוץ הרבה יותר במהלך שלב הדגירה שלאחר החשיפה, וזו הסיבה שמומלץ קירור איטי בן לילה. זה משלים את השלבים הנדרשים ליום הראשון לייצור. מומלץ להמשיך לחלק הבא למחרת.

2. פיתוח (1 - 2 שעות)

1. כאשר מוכנים לפתח את הוופל החשוף, השג מיכל נקי ומפתח פוטו-רזיסט מתאים. כאן, מפתח MF-319 משמש עם מיכל ייעודי.
   זהירות: טפל במפתח עם כפפות והגנה על העיניים, העבר את המיכל בתפזורת למיכל משני והשליך אותו בהתאם לפרוטוקולים הספציפיים ליצרן/לאתר.
2. יוצקים מספיק מפתח לתוך המיכל כדי לטבול את הוופל החשוף במלואו (הנפח בפועל ישתנה בהתאם למיכל).
3. טבלו את הפרוסה החשופה במפתח והמתינו עד שכל ההתנגדות הלא רצויה לאור תתמוסס. סיבוב/ערבוב עדין של המיכל מסייע בפיתוח עד שנראה מעט שאריות פוטו-רזיסט על הפרוסה מלבד עיצוב המכשיר.
   הערה: ייתכן שיידרשו שינויים מרובים של פתרון המפתחים כדי להסיר לחלוטין את ההתנגדות הלא רצויה לאור, בהתאם לנפח הפתרון למפתח שבו נעשה שימוש.
4. הסר את הוופל שפותח מתמיסת הפיתוח ושטוף בעדינות את שני צידי הוופל במים נטולי יונים (DI) למשך 30 שניות.
5. יבש את הוופל המפותח בגז חנקן (N₂).
6. אחסן את הוופל המפותח בצלחת פטרי בסביבה יבשה וקרירה עד שהוא מוכן לשימוש נוסף. עטפו את צלחת הפטרי בנייר אלומיניום כדי למנוע השפלה של הפוטו-רזיסט עקב חשיפה לאור הסביבה.
   הערה: מומלץ, אך לא חובה, להמשיך לסעיף הבא באותו היום.

3. סילניזציה (1 - 2 שעות)

1. העבירו את פרוסת הסיליקון לחומר ייבוש.
2. מניחים מיכל אלומיניום קטן (או חתיכת נייר אלומיניום מקופלת לצורת מיכל) בחומר הייבוש.
3. הכניסו טיפה אחת (~50 מיקרוליטר) של טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאן לתוך מיכל האלומיניום.
   זהירות: טפל בתמיסת סילאן עם כפפות ומגן עיניים והשליך אותה בהתאם לפרוטוקולים הספציפיים ליצרן/אתר.
4. סגור את מייבש הכביסה והפעל את הוואקום.
5. אפשר ייבוש/סילניזציה להתרחש למשך 1-2 שעות.
6. לאחר סיום זמן הסילניזציה, כבה את הוואקום ואחזר את הוופל הסילני. אחסן את הוופל הסילאני בצלחת פטרי עטופה בנייר אלומיניום בסביבה יבשה וקרירה עד שמוכן לשימוש נוסף.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לחזור על סילניזציה מעת לעת על הפרוסות ובתדירות גבוהה יותר במכשירים שבהם נעשה שימוש בשכבות דקות יותר של PDMS. אם מבחינים בהידבקות PDMS בעת הוצאת ה-PDMS מהרקיק, ייתכן שיהיה צורך לסילן מחדש את הוופל, ויש לחזור על סעיף זה לאחר הסרת כל ה-PDMS מהפרוסה. זה משלים את השלבים הנדרשים ליצירת מאסטרים למכשירים מיקרופלואידיים. המאסטרים יציבים וניתן לבצע את הקטעים הבאים כאשר רוצים.

4. תצהיר PDMS (1 - 2 שעות)

הערה: אם יש שאריות PDMS על המאסטר ממיקרו-ייצור קודם, יש להסיר את שאריות ה-PDMS לפני הפקדת PDMS חדשים.

1. במשקל, שקלו למיכל PDMS וחומר ריפוי נלווה ביחס משקל של 10:1. המשקל הכולל הנדרש ישתנה בהתאם לעובי ה-PDMS הרצוי ולגודל צלחת הפטרי. עבור צלחת פטרי בגודל 4 אינץ', ~20 גרם PDMS ו~2 גרם חומר ריפוי יניבו עובי של 2-3 מ"מ.
   זהירות: טפל בתמיסת PDMS עם כפפות והגנה על העיניים והשליך אותה בהתאם לפרוטוקולים הספציפיים ליצרן/אתר.
2. מערבבים את ה-PDMS וחומר הריפוי במיכל למשך 5 דקות בעזרת מרית פלסטיק או כלי מתאים אחר.
3. העבירו את מיכל ה-PDMS המעורב לחומר ייבוש להסרת גזים.
4. סגור את מייבש הכביסה והפעל את הוואקום. בועות אוויר יתחילו להופיע ב- PDMS.
5. אפשר לייבוש/הסרת גז להתרחש למשך 30 דקות. בהתאם לכמות ה-PDMS בשימוש ולצורת המיכל, הזמן בפועל עשוי להשתנות; נקודת קצה כללית היא כאשר מעט בועות קיימות ב-PDMS.
6. לאחר הסרת הגז, כבה את הוואקום ואחזר את מיכל ה-PDMS.
7. יוצקים את ה-PDMS המעורבב והנטול גז על המאסטר בצלחת פטרי.
8. דגרו את המאסטר בצלחת הפטרי הסגורה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר ל-PDMS להתרפא במלואו.
   הערה: פעולה זו משלימה את השלבים עבור תצהיר PDMS. מומלץ לאפשר ל-PDMS להתרפא באינקובטור למשך הלילה. לאחר מכן ה-PDMS יציב, כך שניתן לבצע את החלקים הבאים כאשר רוצים.

5. מכלול מכשיר PDMS (1 - 2 שעות)

1. אחזר את מאסטר המכשירים שריפא PDMS, זוג מלקחיים, אגרוף ביופסיה סטנדרטי של 1.5 מ"מ עם בוכנה ידנית ואזמל/סכין גילוח.
   זהירות: טפל בלהב בזהירות ולעולם אל תחתוך לכיוון עצמך או לאחרים. מומלץ להב נסוג מעצמו או בטיחות.
2. סביב תכונות המכשיר, גזרו חתיכות מלבניות של PDMS ממאסטר השכבות. ודא שלכל חלק של PDMS יש מקום בכל צד, לצד תכונות המכשיר כדי להקל על מגע הדבקה טוב תוך הבטחה שכל חלק מתאים לכיסוי זכוכית של 22 מ"מ × 22 מ"מ משלו.
   הערה: חשוב להימנע מנגיעה במשטח התחתון של ה-PDMS (הצד עם התכונות), לכן טפל תמיד ב-PDMS בקצוות באמצעות פינצטה. בנוסף, לעולם אל תניח את צד התכונה של ה-PDMS כלפי מטה על משטח כלשהו. כאשר אינו בשימוש, אחסן את ה-PDMS כשצד התכונה פונה כלפי מעלה במיכל סגור עד לצורך.
3. נקב חורי כניסה ויציאה בחלקי PDMS באמצעות ניקוב חורים נקי של 1.5 מ"מ. נקב את ה-PDMS של המכשיר לשכבה רזרבית של PDMS קורבן במקום לתוך משטח קשיח שעלול לפגוע באגרוף החורים.
4. אחזר ונקה כיסוי זכוכית בגודל 22 מ"מ × 22 מ"מ עם מגבון רטוב איזופרופיל אלכוהול (IPA).
5. נקה פלזמה את הכיסוי בגודל 22 מ"מ ×-22 מ"מ למשך 5 דקות בוואקום (לחץ < 0.5 Torr) באמצעות פלזמה CDA. זה יסיר כל פסולת או ציפויים אורגניים על הכיסוי.
6. נגב את כיסוי הזכוכית בגודל 22 מ"מ ×-22 מ"מ ואת צד התכונה של ה-PDMS עם מגבון רטוב IPA.
7. הנח גם את ה-PDMS (צד התכונה פונה כלפי מעלה) וגם את כיסוי הזכוכית (אותו צד הפונה כלפי מעלה כפי שנוקה קודם) לתוך שואב הפלזמה ונקה פלזמה בו זמנית למשך 30 שניות בוואקום (לחץ < 0.5 Torr) באמצעות פלזמה CDA.
8. הסר גם את כיסוי הזכוכית וגם את מכשיר ה-PDMS ממנקה הפלזמה. הפוך את ה-PDMS כך שצד התכונה פונה כלפי מטה והנח אותו על כיסוי הזכוכית. שימו לב להדבקה ולחצו קלות על ה-PDMS לפי הצורך כדי להקל על מגע טוב.
9. דגרו את הכיסוי המלוכד בצלחת פטרי סגורה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות כדי להקל על ההדבקה.
   הערה: מליטה פלזמה משנה את ההידרופוביות של כיסוי הזכוכית, ויוצרת משטח הידרופילי. נצפה באמצעות עדויות אנקדוטליות כי המצב ההידרופובי המקורי של הכיסוי חוזר לאחר כיומיים של דגירה בטמפרטורת החדר. מומלץ להשתמש במכשירים מפוברקים לא לפני יומיים לאחר הדבקת הפלזמה. זה משלים את שלבי המיקרו-ייצור. למכשירים אין חיי מדף מוגדרים אך יש לאחסן אותם באזור קריר ויבש כאשר אינם בשימוש.

6. הכנת תעלת זרימה מיקרופלואידית (1 שעה)

1. אבטח מכשיר מיקרופלואידית מורכב למתאם במה מותאם אישית נקי⁴⁷.
2. אחזר מזרק, מתאם לור-לוק וטבעת מתאימה, וחתיכת צינור שקוף בקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ (אורך של כ-15-20 ס"מ). חבר את הצינור למזרק באמצעות המתאם.
3. חבר שלוש חתיכות נוספות של צינורות לשקעי המכשיר המיקרופלואידיים (צינור זה אינו חייב להיות באורך ספציפי) וכוון את הקצה השני של צינורות אלה לבקבוקון פסולת במורד הזרם.
4. בעזרת המזרק, הכינו את המכשיר המיקרופלואידי על ידי הכנסת פתרונות לפי השלבים הבאים. הרצף והנפח של התמיסות הם כדלקמן: 50 מיקרוליטר של תמיסת חיץ BRB80, 25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים נגד רודמין, המתינו 5 דקות, 50 מיקרוליטר של BRB80, 25 מיקרוליטר של פולוקסמר 407 (F127), המתינו 15 דקות ו-50 מיקרוליטר של BRB80. ראה טבלה 1 לדוגמא.
   1. משוך את התמיסה ממקורה לתוך הצינור.
      הערה: אל תמשוך את התמיסה עד הסוף לתוך המזרק עצמו. הפתרון צריך להישאר רק בצינור.
   2. לחץ בעדינות כלפי מטה על בוכנת המזרק עד שנמצאת טיפת נוזל קטנה בקצה הצינור. זה ימנע כניסת אוויר למכשיר המיקרופלואידי כאשר הצינור מחובר.
   3. חבר את הצינור לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי.
   4. לחץ לאט כלפי מטה על בוכנת המזרק עד שרוב התמיסה עפה דרך הצינור, אך לא כולה. השארת כמות קטנה של נוזלים בצינור תבטיח שלא ייאלץ אוויר בטעות דרך הצינור. התבונן בצינורות ובתעלות המיקרופלואידיות במהלך העברות אלה, וחפש בועות כלשהן.
      הערה: אם מתרחשות בועות בצינור, התחל בפתרון בעיות (נסה להסיר את הבועה לפני כניסתה למכשיר המיקרופלואידי על ידי ניתוק הצינור ממש לפני שהבועה מגיעה ולאחר מכן חיבור מחדש של הצינור לאחר שהבועה עוברת וכו').
   5. חזור על שלבים 6.4.1-6.4.4 עבור המגיב הבא עד שכל הריאגנטים יוטסו. יהיה צורך בחתיכת צינור כניסה חדשה עבור כל מגיב כדי למנוע זיהום צולב של ריאגנטים מקוריים. לאחר השלמת הכביסה הסופית של BRB80, המכשיר יציב למשך מספר דקות. טיפה של תמיסת BRB80 על הכניסות תמנע את התייבשות המכשיר.
5. הכן 'זרעים' מיקרו-צינוריים מיוצבים גואנוזין-5'-[(α,β)-מתילנו]טריפוספט (GMPCPP) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים (עם יחס תיוג TTR של ~25%)^47,48.
6. הכן תמיסת חיץ הדמיה ('אנטיפייד') בריכוז עבודה פי 2 על ידי שילוב הריאגנטים הבאים בכמויות המתאימות (בהתאם לריכוזי המלאי) כדי להניב את הריכוזים הסופיים שצוינו: BRB80 בתוספת 40 מ"מ גלוקוז, 40 מיקרוגרם/מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 16 מיקרוגרם/מ"ל קטלאז, 0.5 מ"ג/מ"ל קזאין, 50 מ"מ אשלגן כלורי ו-10 מ"מ דיתיותרייטול (DTT). מאגר הדמיה זה משמש להארכת יציבות האור. ראה טבלה 2 לדוגמא.
7. יש לדלל חלק מתמיסת האנטי-דהייה 2x 1:1 ב-BRB80 כדי להניב פתרון עבודה פי 1 של אנטי-דהייה. לחמם את האנטי-דהייה הזו לטמפרטורת החדר (RT); יש לשמור את תמיסת האנטי-דהייה על הקרח.

הזמנה	ריאגנטים	דילול נפח	נפח כביסה	זמן הדגירה
1	BRB80	לא ישים	50 מיקרוליטר	לא ישים
2	נוגדן נגד רודמין	1:50 ב-BRB80, מערבבים היטב	25 מיקרוליטר	5 דק'
3	BRB80	לא ישים	50 מיקרוליטר	לא ישים
4	פולוקסמר 407 (F127)	1% ב-BRB80	25 מיקרוליטר	15 דק'
5	BRB80	לא ישים	50 מיקרוליטר	לא ישים

טבלה 1: סדר ההכנה של תעלות מכשירים מיקרופלואידיים.

נפח	מגיב	ריכוז מלאי	ריכוז סופי
16 מיקרוליטר	D-גלוקוז	2 מ'	80 מ"מ
16 מיקרוליטר	גלוקוז אוקסידאז	2 מ"ג/מ"ל	80 מיקרוגרם/מ"ל
16 מיקרוליטר	קטלאז	0.8 מ"ג/מ"ל	32 מיקרוגרם/מ"ל
14 מיקרוליטר	קזאין	28 מ"ג/מ"ל	0.16 מ"ג/מ"ל
8 מיקרוליטר	DTT	1 מ'	20 מ"מ
40 מיקרוליטר	אשלגן כלורי	1 מ'	100 מ"מ
290 מיקרוליטר	BRB80	1x	לא ישים
400 מיקרוליטר	סופי (ריכוז עבודה פי 2)

טבלה 2: מתכון לתמיסת הדמיה נגד דהייה (ריכוז פי 2).

7.  הכנסת זרעי מיקרו-צינורות למיקרופלואידית (10 - 15 דקות)

1. חבר את המכשיר המיקרופלואידי למיקרוסקופ.
   הערה: מכיוון שיציבות המיקרו-צינורות תלויה בטמפרטורה, מומלץ לבצע את ניסויי ההדמיה ב-35 מעלות צלזיוס.
2. חבר 10-15 ס"מ של צינורות חדשים למזרק ושאב דילול רצוי של זרעי מיקרו-צינורות מיוצבים GMPCPP לתוך הצינור.
   הערה: עבור מכשיר זה, ~10 ננומטר GMPCPP-זרעי מיקרו-צינורות היה הריכוז האופטימלי.
3. לחץ בעדינות כלפי מטה על בוכנת המזרק עד שנמצאת טיפת נוזל קטנה בקצה הצינור. זה ימנע כניסת אוויר למכשיר המיקרופלואידי כאשר הצינור מחובר.
4. חבר את הצינור לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי.
5. לחץ לאט כלפי מטה על בוכנת המזרק עד שרוב התמיסה עפה דרך הצינור, אך לא כולה. השארת כמות קטנה של נוזלים בצינור תבטיח שלא ייאלץ אוויר בטעות דרך הצינור.
6. נתק את צינור הכניסה מהמכשיר המיקרופלואידי והמזרק והצמד חתיכת צינור חדשה למזרק.
7. משוך BRB80 לתוך הצינור.
8. חזור על שלבים 7.3-7.6 כדי לשטוף זרעי מיקרו-צינורות שאינם קשורים מהמכשיר.
9. שימו לב להצמדת הזרעים למשטח המיקרופלואידי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללת (TIRF). המספר האידיאלי של זרעים בשדה ראייה יחיד ישתנה בהתאם ליישום ולגודל שדה הראייה, אך באופן כללי, ~10-20 זרעים לכל 80 מיקרומטר × 80 מיקרומטר שדה ראייה הוא אופטימלי. חזור על שלבים 7.2-7.9 לפי הצורך עד שתגיע לצפיפות הזרעים הרצויה.
   הערה: לניטור צפיפות זרעי המיקרו-צינורות, יש להשתמש בחשיפה לאור קצר לסירוגין (100 אלפיות השנייה) מכיוון שעדיין אין אנטי-דהייה בתמיסה.
10. לאחר הגעה לצפיפות הזרעים הקשורה המתאימה, חבר חתיכה חדשה של צינור כניסה למזרק.
11. שאב תמיסת אנטי-דהייה חמה 1x לתוך הצינור וחזור על שלבים 7.3-7.6.
    הערה: עם תמיסת האנטי-דהייה כעת במכשיר, היציבות באור משופרת משמעותית והמכשיר יציב. עם זאת, עדיין מומלץ למזער את החשיפה לאור לייזר.

8. גידול הרחבות מיקרו-צינורות מזרעים (15 - 30 דקות)

1. שלב טובולין עם תווית פלואורסצנטית, טובולין ללא תווית, תמיסת אנטי-דהייה 2x, גואנוזין-5'-טריפוספט (GTP) ו-BRB80 כדי להשיג פתרון סופי המכיל 14 מיקרומטר טובולין ביחס תיוג פלואורסצנטי של 7%, נוגד דהייה בריכוז עבודה פי 1 ו-1 מ"מ GTP.
   הערה: אם משתמשים בריכוזים שונים או באחוזי תיוג שונים של טובולין, יהיה צורך להתאים את הנפח של כל מגיב כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי ויחס התיוג. שמור את תמיסת הטובולין על קרח עד ~30 שניות לפני ההחדרה, ובשלב זה, הסר את התמיסה מהקרח וחמם אותה ביד ל-RT. זה יסייע בפילמור של הרחבות מיקרו-צינוריות, שהוא תהליך תלוי טמפרטורה. ואכן, פילמור מיקרו-צינורות צריך להתבצע ב-35 מעלות צלזיוס, בעוד שניתן לבצע את כל שאר שלבי הניסוי ב-RT.
2. חבר 10-15 ס"מ של צינור חדש למזרק ושאב תמיסת טובולין לתוך הצינור.
3. לחץ בעדינות כלפי מטה על בוכנת המזרק עד שנמצאת טיפת נוזל קטנה בקצה הצינור. זה ימנע כניסת אוויר למכשיר המיקרופלואידי כאשר הצינור מחובר.
4. חבר את הצינור לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי.
5. לחץ לאט כלפי מטה על בוכנת המזרק עד שרוב התמיסה עפה דרך הצינור, אך לא כולה. השארת כמות קטנה של נוזלים בצינור תבטיח שלא ייאלץ אוויר בטעות דרך הצינור. נתק את צינור הכניסה מהמכשיר המיקרופלואידי.
6. תמונה בתדר הרצוי למשך 10-15 דקות או עד שההארכות ארוכות מספיק כדי להתכופף. בדרך כלל, הדמיה מתבצעת ב-488 ננומטר כל 5 שניות ו-561 ננומטר כל 60 שניות עד שההרחבות מגיעות באורך של לפחות 5-10 מיקרומטר (~15 דקות).
   הערה: בריכוז זה של טובולין, המיקרו-צינורות עשויים לעבור באופן סטוכסטי בין תקופות של פילמור ודה-פולימריזציה; זה צפוי, אך בסך הכל, הרחבות המיקרו-צינורות יתארכו⁴⁹.

9. ייצוב הרחבות מיקרו-צינורות (10-15 דקות)

1. שלב טקסול, תמיסת אנטי-פייד 2x ו-BRB80 כדי להשיג פתרון סופי המכיל 10 מיקרומטר טקסול ואנטי-דהייה בריכוז עבודה פי 1.
   הערה: שמור את תמיסת הטקסול על הקרח עד ~30 שניות לפני ההחדרה, ואז הסר את התמיסה מהקרח וחמם אותה ביד ל-RT. זה ימנע דה-פולימריזציה של הרחבות מיקרו-צינוריות, שהוא תהליך תלוי טמפרטורה.
2. חבר 10-15 ס"מ של צינור חדש למזרק ושאב תמיסת טקסול לתוך הצינור.
3. לחץ בעדינות כלפי מטה על בוכנת המזרק עד שנמצאת טיפת נוזל קטנה בקצה הצינור. זה ימנע כניסת אוויר למכשיר המיקרופלואידי כאשר הצינור מחובר.
4. חבר את הצינור לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי.
5. לחץ כלפי מטה על בוכנת המזרק עד שרוב התמיסה עפה דרך הצינור, אך לא כולה. השארת כמות קטנה של נוזלים בצינור תבטיח שלא ייאלץ אוויר בטעות דרך הצינור.
6. חזור על שלבים 9.2-9.5 פעמיים ברצף מהיר. ניתן להשתמש באותה פיסת צינור במקרה זה.
   הערה: טקסול מקדם גרעין מיקרו-צינורות דה נובו מטובולין בתמיסה, ומיקרו-צינורות אלה יכולים לנחות על פני התעלה המיקרופלואידית ולהפריע להדמיה/כיפוף שלאחר מכן. מסיבה זו, תמיסת הטקסול צריכה לזרום דרך המכשיר במהירות ובמספר איטרציות כדי להסיר כמה שיותר טובולין חופשי מהמכשיר במהירות האפשרית.
7. ודא שמיקרו-צינורות הגדלים מזרעים עדיין קיימים ומיוצבים במכשיר.

10. כיפוף הרחבות מיקרו-צינורות מיוצבות (10 - 15 דקות)

הערה: כעת ניתן לכופף הרחבות מיקרו-צינורות מיוצבות באמצעות בקר זרימה. כאן, נעשה שימוש במערכת תזוזה מווסתת בלחץ חיובי (Elveflow OB1 MK3+) כדי להזרים את התמיסה מבקבוקון מקור אטום דרך מד זרימה ולתוך המיקרופלואידיק. בהתאם לפרטים הספציפיים של הגדרת בקר הזרימה הזמינה, ייתכן שיבוצעו שינויים בשלבים הבאים.

1. הגדר בקר זרימה וציוד נלווה לפי פרוטוקולים ספציפיים ליצרן/אתר, באמצעות צינורות כדי לחבר את בקבוקון המקור לכניסת מד הזרימה ואת יציאת מד הזרימה לכניסת המיקרופלואידית, אך אל תחבר את הצינור למכשיר המיקרופלואידי.
2. הכנס ~200 מיקרוליטר מתמיסת טקסול 10 מיקרומטר לבקבוקון מקור שניתן לחבר למערך בקר הזרימה. הגדרה זו משתמשת בחיבורי Luer-lock כדי ליצור אטימה אטומה.
3. הפעל את מערכת בקרת הזרימה ופתח את הצינור כדי להסיר אוויר. זה ימנע כניסת אוויר למכשיר המיקרופלואידי כאשר הצינור מחובר.
4. לאחר שהצינור הוכנס דרך מד הזרימה ויש טיפת נוזל קטנה בקצה הצינור, כבה את מערכת בקרת הזרימה.
5. חבר את הצינור לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי. השתמש בכניסה בניצב לכניסה המשמשת להכנסת זרעי המיקרו-צינורות ולגדל את הרחבות המיקרו-צינורות על מנת להתכופף אורתוגונלית.
6. כופפו הרחבות על ידי התחלה ועצירה של זרימה בקצב הזרימה או הלחץ הרצויים. לחץ של 30 mbar הוא הסטנדרט לפרוטוקול זה באמצעות זרימה תנודתית של 5 שניות. דמיין את הכיפוף במהלך תקופה זו, בדרך כלל כל 0.1 שניות ב-488 ננומטר וכל 10 שניות ב-561 ננומטר.
   הערה: זה משלים את בדיקת כיפוף המיקרו-צינורות הבסיסית. ניתן לנקות/להשליך את כל הציוד והריאגנטים בהתאם לפרוטוקולים הספציפיים ליצרן/אתר.

תוצאות

רציונל תכנון מכשיר מיקרופלואידי
התכנון של המכשיר המיקרופלואידי במחקר זה הונחה על ידי מספר מאפיינים מרכזיים (איור 2), אשר בונים ומשפרים את העיצוב המסורתי של תאי זרימה פשוטים. יש לציין כי למכשיר המיקרופלואידי יש נפח פנימי של ~160 ננוטר, קטן משמעותית מנפח ~10 מיקרוליטר של תאי זרימה מסורתיים יותר⁴⁷, מה שמאפשר שימוש מבוקר יותר בריאגנטים יקרי ערך, כגון רכיבי חלבון מטוהרים. מכיוון שבקר הזרימה המיקרופלואידי מכיל שני ערוצי ויסות, המכשיר פותח בהנחה שרק לשתי יציאות כניסה/יציאה תהיה בקרת לחץ בכל זמן נתון. ניתן ליישם יותר ערוצים מבוקרי לחץ, אם תרצה.

איור 2: סכמטי של תכן ההתקן המיקרו-נוזלי. סימונים מלבניים בפריפריה מיועדים לסיוע חזותי בראיית היקף הערוצים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תא ההתקן המלבני המרכזי משמש כאזור ההדמיה העיקרי שבו מחוברים זרעי מיקרו-צינוריות, והרחבות מיקרו-צינוריות מפולימרים מזרעים אלה. החדר נחצה על ידי תעלת זרימה מכל צד, כאשר תעלות ישרות לאורך ציר ה-x משמשות ככניסה ויציאה כדי להקל על החלפה מהירה של תמיסת התגובה. תעלת כניסת מיקרו-צינורות משמשת גם להחדרת זרעי מיקרו-צינורות לתא, עם זרימה למינרית וכתוצאה מכך הזרע נקשר למשטח הזכוכית לאורך כיוון הזרימה. בכיוון הניצב (ציר Y), תעלות הזרימה מסתעפות לתעלות קטנות יותר לכיוון החדר, בדומה לחלק מהעיצובים הקודמים 25,28,36,39. גיאומטריית ההסתעפות מתאימה במיוחד לחקר התכונות המכניות של מיקרו-צינורות. הזרמת תמיסה לתוך החדר המרכזי מכיוון הניצב לכיוון זרעי המיקרו-צינוריות מאפשרת כוחות כיפוף המושרים על ידי זרימה בזוויות כמעט נורמליות. יתר על כן, הכללת גיאומטריית הסתעפות עם ערוצי זרימה קטנים יותר מאפשרת הפעלת כוח הומוגנית יותר על פני שטח רחב של החדר המרכזי, שאינו מושג על ידי גיאומטריית זרימה פשוטה של ערוץ יחיד. באופן זה, מוטיב ההסתעפות, למרות שהוא לכאורה מסובך יותר, יכול להפחית את המורכבות הכוללת בקביעת הכוח המוענק למיקרו-צינורות (איור 3). עיצוב זה כולל גם קווי סימטריה מרובים, המאפשרים קלות שימוש והזדמנות להעריך כיפוף מכמה כיוונים (למשל, למעלה לעומת למטה).

איור 3: הכללת מוטיב הסתעפות מביאה לשטח גדול של זרימה דומה. סימולציות של שני עיצובי מכשירים בזרימה במצב יציב: אחד ללא ערוצים מסתעפים (A) ואחד עם ערוצים מסתעפים (B). החצים מציינים כיוון זרימה מקומי והם פרופורציונליים לגודל הזרימה. צבע פני השטח מציין את מהירות קו המרכז. תמונות מימין מראות קטע מוגדל של המכשיר שבו מיקרו-צינורות (לא מוצגים) המכוונים לאורך ציר ה-x יהיו נתונים לכוחות כיפוף מנוזל הזורם ביציאה העליונה והחוצה מהיציאה התחתונה. שילוב תעלות הסתעפות מגדיל את השטח היחסי הנתון לשדות מהירות דומים מבלי להגדיל את נפח המגיב הנדרש. נתון זה שונה באישור רוג'רס (2022)¹⁴. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

יש לציין כי המכשיר מיישם גם סדרה של מלכודות בועות בתעלות זרימת הכניסה והיציאה כדי למנוע כניסת בועות אוויר לתא ההדמיה המרכזי. באופן ספציפי, בחרנו לכלול מערכים של מיקרו-עמודים בתוך נתיב הזרימה על מנת לחסום בועות אוויר מלעבור בגלל מתח פנים (איור 2)⁴⁶. יתר על כן, כדי למנוע כניסת אוויר, עיצבנו את הקצוות בתוך המכשיר כקימורים חלקים, בניגוד לזוויות אלכסוניות. יחד, תכונות עיצוב אלה מפחיתות את האפשרות לבועות אוויר ומגבירות את חוסן המכשיר.

ייצור מכשירים מיקרופלואידיים
קביעת הפרמטרים המתאימים ליצירת מאסטר המכשיר דרשה אופטימיזציה מסוימת. כפי שנצפה קודם לכן, פוטו-רזיסט זה רגיש מאוד לפרמטרי הפעלה מרכזיים כגון תאורת סביבה ושיעורי החימום והקירור במהלך שלבי הפוטוליתוגרפיה⁵⁰. לדוגמה, אם המאסטר התקרר מהר מדי לאחר החימום, עלולים להתפתח סדקים תרמיים בפוטו-רזיסט. זה לא רצוי, מכיוון שהסדקים עלולים לפגוע בשלמות הערוץ. בעוד שניתן לפתור סדקים על ידי חימום מחדש של ההתנגדות לטמפרטורה הקרובה לטמפרטורת המעבר שלה (~115 מעלות צלזיוס), מצאנו שמתן אפשרות למאסטר להתקרר באופן סביבתי על הפלטה החמה הייתה הדרך החזקה ביותר למנוע סדקים. יתר על כן, עודף אור סביבתי עלול לגרום לחשיפה לא מכוונת של הפוטו-רזיסט, להחליש את ההתנגדות וכתוצאה מכך תכונות המכשיר עצמן (שאמורות להישאר על הפרוסה לאחר הפיתוח) עוברות הפשטה חלקית במהלך שלב הפיתוח. מסיבה זו, אנו מעודדים את שלב הפיתוח להתבצע ביום שלאחר שלבי האפייה שלאחר החשיפה ושלבי קירור הלילה. יתר על כן, בכל פעם שהמכשיר הראשי אינו בשימוש, אנו ממליצים לאחסן אותו באזור חשוך או עטוף בנייר אלומיניום כדי למנוע השפלה לאורך זמן. ברגע שהפרמטרים האלה נקבעו, תהליך הפוטוליתוגרפיה היה מאוד חוזר על עצמו (איור 4).

לאחר יצירת המאסטר, PDMS נוזלי נוצק על גבי המאסטר, מה שאפשר ל-PDMS לרפא וליצור חותם שלילי של תווי המאסטר. מצאנו כי יציקת ה-PDMS בעובי של 2-3 מ"מ אפשרה מניפולציה קלה של המכשירים; לעומת זאת, אם מצופה ספין כדי להשיג עובי בתחום המיקרומטר, ה-PDMS היה נוטה להיקרע או להיצמד לעצמו, מה שהקשה על המניפולציה. יתר על כן, שכבת PDMS עבה יותר מאפשרת חיבור קל יותר של צינורות, מכיוון שהצינור יישאר ביציאות הכניסה/יציאה ללא צורך בחומר איטום או מהדק.

לבסוף, בעוד שבדיקות תאי זרימה מסורתיות ליישומים ביולוגיים אלה משתמשות לעתים קרובות בכיסויי זכוכית שנוקו מראש באמצעות תמיסת פיראנה (מי חמצן וחומצה גופרתית) ולאחר מכן סילאנו, מצאנו כי כיסויים שטופלו בניקוי פלזמה מורחב ושטיפת IPA התאימו למטרותינו⁴⁷. יישומים אחרים, כגון הדמיה של מולקולה אחת, עשויים לדרוש טיפול נרחב יותר בזכוכית כיסוי.

איור 4: תהליך פוטוליתוגרפיה. (A) המסכה עם העיצוב הרצוי (מסכה עשויה מכרום חרוט על זכוכית). (B) סדקים קלים של פוטו-רזיסט על פרוסת הסיליקון עקב מתח תרמי (חיצים מדגישים כמה סדקים). סדקים אלה נמתחים לעתים קרובות על פני כל הוופל. (ג) המאסטר המפותח. (D) המערך המיקרופלואידי במיקרוסקופ. רכיבים בודדים מסומנים בירוק. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

צמיחה, ייצוב וכיפוף של מיקרו-צינורות
זרעי מיקרו-צינורות הגדלים ב-GMPCPP משמשים כאתרי גרעין להרחבות מיקרו-צינורות לפילמור והם עצמם יציבים מפני דה-פולימריזציה למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר. הזרעים נקשרו לכיסוי הזכוכית בתעלה המיקרופלואידית באמצעות נוגדן אנטי-רודמין⁴⁷. לאחר מכן גודלו הרחבות מיקרו-צינורות דינמיות בנוכחות טובולין מסיס (מסומן פלואורסצנטי אך לא מצומד לרודמין) ו-GTP. בדרך זו, אתרי גרעין הזרעים חוברו לכיסוי הזכוכית, אך ההרחבות לא הוצמדו. במהלך תקופת הגידול של 15 דקות, הרחבות המיקרו-צינורות עוברות פילמור ודה-פולימר באופן סטוכסטי, כצפוי בשל חוסר היציבות הדינמית הפנימית שלהן⁴⁹. לאחר תקופת גידול זו, בוצעה שטיפת טקסול של 10 מיקרומטר כדי לחסל את כל הטובולין שנותר מהתמיסה ולייצב את הרחבות המיקרו-צינורות שנוצרו. הייצוב הוא המפתח, מכיוון שהרחבות המיקרו-צינורות היו מתפרקות עם דלדול הטובולין. בנוסף לקשירת וייצוב פולימר מיקרו-צינוריות, טקסול הוכח גם כמשפיע על מכניקת המיקרו-צינורות ועשוי לגרום לעקמומיות בהרחבות המיקרו-צינורות הליניאריות^אחרת 51,52,53,54. התוצאות המוצגות כאן שיקפו את התצפיות הללו; עם זאת, סלסול הרחבות המיקרו-צינורות אינו רצוי, מכיוון שהדבר גורם לכוחות לא אחידים המועברים לאורך הסריג במהלך הכיפוף. לכן, רק מיקרו-צינורות שנשארו ישרים יחסית לאחר הייצוב שימשו לניתוח כיפוף. לחלופין, לאחר תקופת הגידול הראשונית, ניתן להשתמש בתקופת גידול משנית עם תמיסה של טובולין ו-GMPCPP (בניגוד ל-GTP הראשוני) כדי ליצור 'כובעים' יציבים בקצוות הצומחים של סריג המיקרו-צינוריות ולמנוע דה-פולימריזציה⁵⁵.

לאחר מכן המיקרו-צינוריות כופפו על ידי זרימה בתמיסת החיץ באמצעות מערכת בקרת הלחץ כדי לשמור על לחץ קבוע במעלה הזרם (איור 5, סרטון משלים 1). בדרך זו, יכולנו להעריך את הזרימה המקומית שחווים המיקרו-צינורות. על ידי הזרמת נוזל פנימה מהחלק העליון והחוצה מיציאת המכשיר התחתונה, כיוון הזרימה נועד להיות מאונך לכיוון הזריעה.

איור 5: ניתן להשתמש במערך המיקרו-נוזלי לכיפוף מיקרו-צינוריות מיוצבות. מיקרו-צינורות במצב מנוחה לאחר ייצוב עם פקליטקסל כפופים במהלך זרימה פועמת. לחץ קבוע במעלה הזרם של 30 mbar מניע זרימה (חץ מציין את כיוון הזרימה). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קביעת פרופיל הזרימה במכשיר המיקרופלואידי
ניתן לדמות את מהירות קו המרכז במיקרופלואידיקה באופן חישובי באמצעות תוכנת COMSOL (תוכנת סימולציה, איור 6A). עם זאת, המיקרו-צינורות מחוברים לכיסוי הזכוכית עבור מיקרוסקופ TIRF בטווח של ~100 ננומטר מהמשטח. לכן, המהירות שחווה המיקרו-צינורית אינה זהה לזו שנחזה בסימולציה הדו-ממדית. כדי להעריך את הזרימה המקומית שחווים המיקרו-צינורות, השתמשנו במשוואת Navier-Stokes הכללית לזרימת נוזל בלתי ניתנת לדחיסה בממד אחד:

כאן, z הוא גובה המיקרו-צינורות במכשיר, h הוא הגובה הכולל של המכשיר, ו-v_c הוא מהירות קו המרכז במכשיר. לפי הגדרת המערכת, מקור z הוא מרכז ההתקן (איור 6B). באמצעות הגדרה זו וגובה תעלה של 13 מיקרומטר, גובה המיקרו-צינורות משוער כ-z = -6.4 מיקרומטר. פתרון משוואה זו מניב אומדן למהירות הנוזל המקומית שחווים המיקרו-צינורות:

איור 6: הגדרת המערכת עבור ניתוח זרימת נוזל של נוזל הנכנס להתקן ביציאה העליונה ויוצא ביציאה התחתונה (יציאות אינן מוצגות). (A) סימולציה של שדה מהירות קו מרכזי בקנה מידה כמו באיור 3B. כוכב מציין את אזור העניין של פאנל B. (B) ייצוג חתך של המכשיר. פרופיל זרימת נוזלים מפותח במלואו הוא בכיוון y עם מהירות קו מרכז v_c ב-z = 0 ומצב גבול ללא החלקה בקירות. שים לב שהחצים בלוח זה אינם בקנה מידה ביחס לשדה המהירות בפועל המוצג בלוח A. נתון זה שונה באישור רוג'רס (2022)¹⁴. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מעבר לסימולציות, ניתן לשלוט במהירות הנוזל באמצעות בקר זרימה המבוסס על קצב זרימה נפחי במקום לשמור על לחץ. יתר על כן, ניתן לקבוע ישירות את קצב הזרימה המקומי בכל מכשיר על ידי הכללת חרוזי פלורסנט וניטור מהירותם, ובכך להקל על כל שונות מדגימה לדגימה.

מודלים חישוביים והדגמות שיפוע
לבסוף, ביצענו סימולציות חישוביות בשילוב עם ניסויים כדי להדגים את היתכנות השימוש במכשיר זה לניסויים בעלי תפוקה גבוהה. יחד עם היכולת לכופף מיקרו-צינוריות לכיוונים מרובים הודות לסימטריה של ההתקן, הסימולציות הראו שההתקן יכול לשמור על שיפועים מדויקים, מה שמאפשר חקירה בו-זמנית של תנאי ניסוי מרובים (איור 7A). ניסויים ראשוניים (שיטות שלא צוינו במפורש כחלק מפרסום זה) שהשתמשו בצבע פלואורסצנטי בתמיסה הראו עקביות עם התחזיות החישוביות (איור 7B). יתר על כן, הדגמנו בהצלחה חלוקה של חלבונים שונים באזורים שונים של המכשיר על ידי גידול בו-זמנית של הרחבות מיקרו-צינוריות עם תוויות פלואורסצנטיות שונות (איור 8). למיטב ידיעתנו, זהו היישום הראשון של מיקרופלואידיקה בתפוקה גבוהה לחקירות מיקרו-צינוריות. ניתן להשתמש בתכונה זו של מכשיר זה כדי להפחית את הזמן והכמויות של ריאגנטים הדרושים תוך שיפור החוסן הניסיוני. לדוגמה, ניתן לחקור בו זמנית את ההשפעות של חלבונים שונים או ריכוזים שונים של חלבונים בודדים על מכניקת המיקרו-צינורות והדינמיקה שלהם במכשיר יחיד.

איור 7: היווצרות שיפוע. (A) סימולציה של שיפוע של שני פתרונות הנכנסים להתקן באותו לחץ כניסה (50 mbar) וריכוז (15 μM). יציאות כניסה עבור כל פתרון מסומנות בחצים צבעוניים (פתרון אחד ביציאה העליונה ופתרון אחר ביציאה הימנית), ושתי היציאות הנותרות משמשות כיציאות. מפת חום מציגה את פרופיל הריכוז של הפתרון העליון. מצב יציב הושג ב-t = 5 שניות. (B) יצירה ניסויית של שיפוע דומה באמצעות צבע פלואורסצנטי בתמיסה ביציאה העליונה ובמאגר ביציאה הימנית. תמונה היא שכבת רסטר שנוצרת על ידי תפירת כל שדה ראייה (80 מיקרומטר × 80 מיקרומטר) כדי לפתור את כל אזור המכשיר. נתון זה שונה באישור רוג'רס (2022)¹⁴. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: הדגמת שיפוע חלבון בהתקן המיקרופלואידי. טובולין עם תווית AlexaFluor647 (מגנטה) הוטס בכניסה 1, וטובולין עם תווית AlexaFluor488 (ירוק) הוטס בכניסה 2 של המכשיר בריכוזים ובקצבי זרימה שווים. הזרימה התנודדה להפעלה/כיבוי במרווחים של 90 שניות כדי לאפשר פילמור טובולין מזרעי GMPCPP מיוצבים (אדום) תוך עיכוב ערבוב. (A) שכבת רסטר בקנה מידה גדול שנעשית על ידי תפירת שדות ראייה (80x80 מיקרומטר) כדי לפתור את כל אורך המכשיר. אותיות מציינות את המיקום היחסי של שדות ראייה בודדים בחלוניות הבאות. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר במצב X ו-Y. (B) שדה ראייה ליד כניסה 1 של המכשיר, כאשר הרחבות מורכבות בעיקר מטובולין עם תווית A647. (C) שדה ראייה ליד מרכז המכשיר, שבו הרחבות מורכבות מתערובת של טובולינים מסומנים, כפי שחזו. (D) שדה ראייה ליד החלק התחתון של המכשיר, כאשר הרחבות מורכבות בעיקר מטובולין עם תווית A488. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת זרימת תהליך (PFD) עבור מערך הניסוי של מיקרופלואידיקה במיקרוסקופ מוצגת באיור משלים 1.

איור משלים 1: דיאגרמת זרימת תהליך (PFD) עבור מערך הניסוי של מיקרופלואידיקה במיקרוסקופ. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

סרטון משלים 1. ניתן להשתמש במערך המיקרופלואידי לכיפוף מיקרו-צינורות מיוצבים. מיקרו-צינורות במצב מנוחה לאחר ייצוב עם פקליטקסל כפופים במהלך זרימה פועמת. לחץ קבוע במעלה הזרם של 30 mbar מניע זרימה. קצב הפעלת וידאו 10 פריימים לשנייה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 1: קובץ CAD של עיצוב המסכה המיקרופלואידית. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה הייתה לתכנן ולייצר מכשיר מיקרופלואידי, המתאים לחקר מכניקת מיקרו-צינוריות במבחנה. התכנון התבסס על הרצון לנצל את היתרונות המהותיים של התקנים מיקרופלואידיים מבוססי PDMS תוך הכללת שילוב של תכונות שיאפשרו ניסויים חזקים וניתנים להתאמה אישית בתפוקה גבוהה.

מטרה זו הושגה בהצלחה, וכתוצאה מכך נוצרו פרוטוקולי ייצור והנחיות כלליות שיכולות לשמש בסיס למשתמשים עתידיים במערכת זו. הכללת מלכודות בועות מיותרות במכשיר מפחיתה את הסבירות לדנטורציה של חלבון עקב נוכחותן של בועות אוויר. אמנם עדיין יש לנו קצת ניתוק וחיבור מחדש של צינורות במכשיר, מלכודות בועות אלה מפחיתות את ההסתברות לכישלון ניסוי. שיפורים עתידיים במערך המיקרופלואידיקה יכולים אפילו להפחית עוד יותר את כמות המניפולציות הידניות של צינורות שבוצעו במהלך ניסוי. יתרה מכך, השילוב של המכשיר המיקרופלואידית עם תוכנת בקרת זרימה אוטומטית מאפשר התאמה אישית משמעותית של תנאי הניסוי תוך הפחתת האפשרות לטעות ידנית. הדגמנו את הביצועים המוצלחים של ההתקן על ידי ייצור המכשיר ולאחר מכן גידול, ייצוב וכיפוף הרחבות מיקרו-צינוריות בהתקן באמצעות זרימה אוטומטית מיוצבת בקר. יתר על כן, על ידי קביעת שיפוע של תמיסות טובולין מובחנות עם תווית פלואורסצנטית בתוך אותו מכשיר, הראינו שניתן להפעיל מספר תנאים בו זמנית במכשיר יחיד. בעזרת טכניקות מודלים וניתוח חישוביים, המערכת שלנו יכולה לחקור ולקבוע את התכונות הביומכניות של מיקרו-צינורות, כגון קשיחות כיפוף 52,56,57,58,59.

שיפורים עתידיים פוטנציאליים יאפשרו מערכת חזקה עוד יותר וניתוח ניסיוני נלווה. ראשית, שקיעת האור-התנגדות, החשיפה והאפייה היו פרמטרים מכריעים שהפגינו שונות מסוימת. גדלי התכונות הגבוהים יחסית של ה-SPR photoresist דרשו חימום וקירור הדרגתיים מאוד כדי למנוע סדקים תרמיים, שעלולים להרוס את המכשירים. בעוד שניסו מכשירים דקים יותר, מצאנו בעיות במניפולציה של גדלי התכונות הקטנים הללו. תשומת לב לפרטים וסבלנות הם חיוניים לשכפול התקנים בעובי זה עם עמידות לאור SPR. ניתן להשתמש בפוטו-רזיסטים שונים כדי לפתור בעיה זו, בהתאם לזמינות.

יחד, המכשיר והפרוטוקול המיקרופלואידיים כאן מאפשרים מגוון של מערכי ניסוי עם יכולות בדיקה חזקות יותר בתפוקה גבוהה מאשר מבחני תאי זרימה קודמים⁴⁷. יתר על כן, ניתן לבצע אוטומציה של ניסויים באמצעות בקרי זרימה כדי לשמור על פרופילי זרימה מדויקים או שיפועי ריכוז במכשיר, מה שמפחית את השונות הטבועה במשתמשים ידניים. יישומים פוטנציאליים עתידיים של מערך זה כוללים חקירת ההשפעות של חלבונים הקשורים למיקרו-צינורות על קשיחות כיפוף המיקרו-צינורות, דינמיקה, נזק לסריג ותיקון, כמו גם האינטראקציות הביומכניות של מיקרו-צינורות וחוטי אקטין 54,60,61,62,63,64,65,66,67,68^,69,70. השילוב של מיקרו-ייצור, בקרת זרימה אוטומטית וטכניקות מידול וניתוח חישוביות יוצר מערכת רב-תכליתית המתאימה לחקר השלד התאי במבחנה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tubes (clear)	Any brand		Low retention type is preferred
1.5 mL microcentrifuge tubes (clear)	Any brand		Low retention type is preferred
1.5 mm standard biopsy punch	Integra LifeSciences	33-31A-P/25
100x/1.49 numerical aperture TIRF objective	Nikon
22 x 22 mm glass coverslips	ThorLabs	CG15CH
3" single side polished silicon wafers	University Wafer	447
4" Petri dish	Any brand
450 µL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube	Beckman Coulter, Inc.	345843	Referred to as 'airfuge tube' in the protocol
488-, 561, and 640-nm solid state lasers	Nikon
A-95 Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter, Inc.	347595
Acetone	Any brand
Airfuge Air-Driven Ultracentrifuge	Beckman Coulter, Inc.	347854	Referred to as 'airfuge' in the protocol
Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	A30006
Aluminum foil	Any brand
Andor iXon Ultra EM-CCD	Nikon
Andor NEO sCMOS	Nikon
AutoCAD	Autodesk		Generic versions can be used
Bovine brain unlabeled tubulin (purified)	N/A		Made in house, but can be purchased
Casein	MilliporeSigma	C7078
Catalase	MilliporeSigma	C9322
Clean Dry Air (CDA) (pressurized gas)	Any brand
Compressed air supply	Any brand		Connects to the microfluidic flow controller
COMSOL Multiphysics software	COMSOL, Inc.
Custom brass stage adapter	N/A		Made in house to fit our 22 mm x 22 mm coverslips onto the microscope
De-ionized water	Any brand
Dessicator	Any brand
D-glucose	MilliporeSigma	G7528
Dithiothreitol (DTT)	MilliporeSigma	D0632
EGTA	MilliporeSigma	324626
Elveflow Smart Interface (ESI) software	Elveflow
Flangeless PFA fittings with ETFE ¼”-28 to 1/16” outer diameter ferrules	Darwin Microfluidics	CIL-XP-245X	Used to connect the tubing from the micrewtube source vials to the flow sensor via the pressurized reservoir rack
Fluiwell 4-Channel 2 mL Low Pressure	Fluigent	14002001	Used to connect the flow control system to the the micrewtubes. Also refered to as 'pressurized reservoir rack'
Fume hood	Any brand
Glucose oxidase	MilliporeSigma	G6125
GMPCPP	Jena Bioscience	NU-405L
Guanosine triphosphate (GTP)	MilliporeSigma	G8877
Hot plate	Any brand
HS-625 high-speed emission filter wheel	Finger Lakes Instrumentation
ImageJ software	N/A		Open access
Incubator	Any brand
Isopropyl alcohol	Any brand
Karl Suss MA-6 mask aligner	SUSS MicroTec
Magnesium chloride	MilliporeSigma	1.05833
MATLAB software	MathWorks
MEGAPOSIT SPR 220 7.0 photoresist	Dow, Inc.
Microfluidic Fittings 6-40 to 1/4"-28 Adapters Kit	Darwin Microfluidics	LVF-KFI-08	Used to connect the tubing from the micrewtube source vials to the flow sensor via the pressurized reservoir rack (Fluiwell rack)
Microfluidic Fittings Female Luer Lock Adapter Kit	Darwin Microfluidics	LVF-KFI-04	Used to connect the syringe to the tubing
Microfluidic flow controller	Elveflow	OB1 MK3+
Microfluidic flow sensor	Elveflow	MFS3	This flow sensor range is 0-80 μL
MICROPOSIT MF-319 developer	Dow, Inc.
Microscope	Nikon	Eclipse Ti
NIS-Elements software	Nikon
Nitrogen (pressurized gas)	Any brand
Objective heater	Tokai Hit
One-Piece Fingertight 10-32 Coned Fitting for 1/16" OD Tubing	Darwin Microfluidics	CIL-F-120X	Used to connect the syringe to the tubing
Paclitaxol (Taxol)	Tocris Bioscience	1097
Photolithography masks	N/A		Made by an external party using our designs
PIPES	Thermo Fisher Scientific	172615000
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Plasma flowmeter system	Harrick Plasma	PDC-FMG	Integrates with plasma cleaner to enable flow control of pressurized gas
Plastic bulb pipet	Any brand
Pluoronic F-127	MilliporeSigma	P2443	Referred to as 'poloxomer 407' in the protocol
Potassium chloride	Research Products International	P41000
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon .020 ID	Thermo Fisher Scientific	50-206-8921	Refered to as '1.5 mm tubing' and 'tubing' in the protocol
Scalpel	Any brand
Spin coater	Cost Effective Equipment, LLC.	200x	This model may be discontinued
Standard pipets and tip sets	Any brand
Standard plastic syringe	Any brand		We used a 10 mL Luer-slip syringe
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow, Inc.		Referred to as 'PDMS' and 'curing agent' in the protocol
T339 Micrewtube with Lip Seal and Flat Screw Cap	Medline Industried, LP.	T339	Referred to as 'source vial' in the protocol. We used both 0.5 mL and 1.5 mL sizes
TAMRA, SE; 5-(and-6)-Carboxytetramethylrhodamine, Succinimidyl Ester	Invitrogen	C1171	Referred to as 'TTR' in the protocol
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	MilliporeSigma	448931
Trion Phantom RIE ICP	Trion Technology, Inc.		This plasma cleaner is only used in Step 1.1 of the protocol. Another plasma cleaner, like the one used for PDMS bonding, can be used instead; we just prefer the much lower vacuum achievable by this system for cleaning the silicon wafer
TRITC Polyclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific	A6397	Referred to as 'anti-rhodamine antibody' in the protocol
Tweezers	Any brand
Vacuum pump	Any brand