המחברים מודים NSF (MCB-1,157,876) למימון. אנו מודים גם אלברטו Civetta, ג&#39;ון Roote, ושני שופטים אלמונים על הערותיהם.

ניסויים בקנה מידה קטנה צריכים להתבצע כדי להכיר את ההליך כולו. 1. איסוף נקבות וזכרי בתולה נאיביים הגרסה הפשוטה של הניסוי שתואר מורכבת מארבעה סוגים של צלבים ראשוניים, אשר כרוך השילוב הבא של מבוגרים: א) יחידים w 1118 על מנת לאסוף נקבות בתולה, ב) יחידים אורגון-R כדי לאסוף זכרים התייחסות נאיביים; ג ) P {} SW זכרים ונקבות הומוזיגוטים בתולה מפס בקרה שמבצע ארגון פראי הסוג של SDIC כדי לאסוף זכרים ניסיוניים נאיביים (סוג I); ו-D) P {} SW זכרים הומוזיגוטים וSDIC-SW-מחיקה נשיאת נקבות בתולה כדי לאסוף זכרים ניסיוניים נאיביים הנושאים את מחסור SDIC-SW (סוג II). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את בקבוקונים המכילים מספר רב של 8-10 נקבות וזכרים 5 כל אחד. לאפשר לנקבות להטיל אתביצים ולהעביר את המבוגרים לבקבוקונים חדשים בכל 3-5 ימים. להשתמש בבקבוקים ולא בבקבוקונים במידת צורך, ותמיד להשתמש במזון טרי. מספר הבקבוקונים הנדרשים יהיה תלוי במספר סוגי גברים ניסיוניים תחת מחקר ואת מספר האנשים העריכו שצריכה כדי לזהות הבדלים (טבלת 1). יותר מ -10 נשים בכל בקבוקון עלולות לגרום לצפיפות יתר במהלך צמיחת הזחל, שעלול לגרום לשינוי בפוריות של הצאצאים. בקבוקונים לאחסן ב -25 ° C בתא בטמפרטורה מבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל לאסוף נקבות וזכרי בתולה נאיביות בימים ה 11 וה 12 לאחר ההגדרה הראשוניים הצלבים. תקופת המתנה משתנה בהתאם לטמפרטורה, תוצאת טמפרטורות נמוכה יותר בזמן ארוך יותר עיכוב התפתחותי האוסף של יחידים. גורם נוסף המשפיע על העיתוי לeclosion הוא הסוג של מדיום. אוכל מזין, כגון קמח תירס, שמרים בינוניים 29, מבטיח התפתחות תקינה של המבוגרמערכת רבייה, המאפשרת הזדווגות. אסוף מבלי שהזדווגו לפני עף כל 4-6 שעות. בעת איסוף, להרדים זבובים על ידי החדרת CO 2 לתוך הבקבוקון, הקש על הזבובים למטה, ומינם תחת stereomicroscope (איור 2). מניחים את הזבובים הרצויים לתוך צלוחיות שונות לפי מין ופנוטיפ ותווית את הבקבוקונים כראוי. </li></ol> שים לב 1. שגרת אוסף מתחילה בבוקר על ידי השלכת את המבוגרים שצצו במהלך הלילה הקודם. לאסוף נקבות וזכרי בתולה נאיביים פעם או פעמיים במהלך היום. בדרך כלל, ד &#39; זכרים melanogaster להיות 8 שעות לבגרות מינית אחרי eclosion של 25 מעלות צלזיוס 30. אם זבובים נשמרים תחת מחזורי אור / חושך הפועל 12:12, שתי פסגות של eclosion צפויות: במהלך 1-2 שעות הראשונה לאחר שהאור דולק, ובמהלך שעות 2 לפני שהאור כבוי. Eclosion מתרחש בתוך 24 שעות לאחר מכהת הגולם. שימו לב 2. לא יותר מ 10 נקבות shולד יהיה להכניס אותו הבקבוקון כדי למנוע צפיפות יתר. זה גם מגביל את ההפסד של נקבות במקרה שיש להם להיות מושלכים, כי לפחות אחד מהם הוא לא בתולה. הערה 3. על מנת לאסוף את המספר המתאים של נקבות וזכרי בתולה תמים בפרק זמן קצר, אפשר לאמץ את הצעדים הבאים. הגדר את הבקבוקונים של 15-20 W 1118 לניסויים מעורבים שני סוגים של גברים ניסיוניים (טבלת 1). קל ומפזרים את פני השטח של כלי התקשורת ולהוסיף כמה כדורי שמרים פעילים יבשים כדי להקל על ההטלה. העבר את ההורים לפחות 4 פעמים ביום ברציפות. כדי להגדיל את השטח זמין להתגלמות בכל בקבוקון, הכנס נייר מקופל רב (7 ס&quot;מ X 5) ביום ה -4 או 5 לאחר שההורים מועברים לתוך בקבוקון נוסף (איור 3). אם מספר המבוגרים עלו מהצלבים ראשוני זה לא מספיק, תחכה לעוד כמה ימים ולאסוף individuALS מבקבוקונים להגדיר בתאריכים שונים. מתכנן לבצע את הניסויים על פני כמה ימים רצופים כדי לאזן את עומס העבודה. 2. ניסויים כפולי הזדווגות איור 4 מציג את השלבים העיקריים מעורבים בניסויים כפול הזדווגות שבוצעו ב14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקרו של יום 1, להגדיר את ההזדווגות הראשונה. הזכרים אורגון-R הם הראשון להזדווג בassay העבירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש aspirator, להגדיר בקבוקונים המכילים 10 נקבות 4-5-בני יומם לבנים עיני w 1118 בתולה וכל אחד מהם 10 גברים נאיביים אדומי עיניים אורגון-R. שנים עד שלושה בקבוקונים מוגדרים ביום למשך 5 ימים רצופים. מספר הבקבוקונים שיוקמו עשוי להשתנות בהתאם למספר אנשים זמינים. לאפשר לזבובים להזדווג במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל זכרים אורגון-R ולמקם כל נקבה לתוך בקבוקון חדש באמצעות aspirator (איור 5). זיהוי מין יכול להיות מושגת על ידי בדיקה ויזואלית של כמההבדלים מורפולוגיים (איור 2). תווית בקבוקון אחד כראוי ולהשאיר את הנקבה בבקבוקון ל2 ימים (להלן &quot;V1&quot;). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להגדיר את הזיווג השני. בחירה של זכרים ולחצות להגדיר צריכה להתבצע באופן אקראי על מנת לצמצם הטיות אפשריות כלפי כל אחד מסוגי הניסויים ממין זכר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעתיים לפני שהאור כבוי, להעביר שוב את הנקבה לתוך בקבוקון חדש עם aspirator. תווית הבקבוקון החדש כראוי (להלן &quot;V2&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את שלושה זכרים ניסיוניים 5-6 ימים בת של אותו גנוטיפ לv2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 2.2.1 ו2.2.2 עבור כל אישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, שתי שעות נכונה לפני שהאור דולקת זכרים (כלומר לא יותר מ -12 שעות לאחר 2.2.1), להשליך על ידי השימוש בaspirator. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 6, להעביר כל נקבה שוב לתוך בקבוקון חדש אחר. לתייג את הבקבוקונים החדשים כראוי (להלן &quot;V3&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 10, לבטל את 1118 w </sup&gt; נקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את progenies בV2 וV3. הבדיקה הראשונה מתבצעת לאחר 13-15 ימים לאחר הנשי מוחדר v2 (או v3), למשל ביום 17 לאחר ovipositing הראשון התחיל הנשי בv2. הבדיקה השנייה מבוצעת בדיוק לאחר 17 ימים. מסגרת זמן זה מציב גבול עליון בטוח זמני שמבטיח לא דור שני באותו הבקבוקון. שתי בדיקות למנוע צפיפות יתר תוך הקלת ספירת צאצאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 17, לבדוק V1 ולהבטיח כי יש צאצאים אדומים עיני הווה, אם לא יציין את הבקבוקון בהתאם. נוכחות של צאצאים לבנים עיניים מצביעה על כך שהנשים לא היו בתולה בעת ההזדווגות ראשונית בעוד שאף צאצאים מציין כי הזדווגות עם ההפניה או הזכרים הניסיוניים לא התרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 17, לבצע את הבדיקה הראשונה של V2. הרדם יצא צאצאים בV2 עם CO 2 ולמיין אותם לפי צבע עיניים ומין. מספרי שיא צאצאי אביהם הראשון והשנייהזכרים ond. איור 6 מציג את פנוטיפים הצפויים בצאצאים של כל ערכת הזדווגות. ב14 ניסוי המסוים הזה, רק נקבת צאצאים ניתן להקצות באופן חד משמעי כהולידו על ידי ההפניה או הזכרים הניסיוניים ולכן רק את המידע מבנות יכול לשמש כדי לחשב P 2. אם עם סמנים אחרים האבהות של צאצאי זכרים ניתן להקצות באופן חד משמעי, ספירת צאצאים של שני המינים ניתן להשתמש בחישובים במורד הזרם. מחק את הצאצאים אבל לשמור v2 לבדיקה שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 20, פעל כב2.5.2 עם הצאצאים יצאו זה עתה בV2 ואז להשליך את הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 20, לבדוק את הצאצאים יצאו בV3 בפעם הראשונה ובצע את השלב 2.5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 23, פעל כב2.5.3 עם הצאצאים יצאו זה עתה בV3. </li></ol></li></ol> הערה 1: בשל השפעה פוטנציאלי ניפוח על ציוני P שהזדווגות מרובה אולי יש לי (2.2.2 ו2.2.3), הזדווגותיכול להיות מוגבל למסגרת זמן מסוימת. מסגרת הזמן תהיה תלויה בתדירות remating קשורה לגנוטיפ של הנקבה והזכרים בשימוש. ההסתברות להזדווגות מרובה מצטמצמת במיוחד במהלך הלילה 11 פעם. הערה 2: אל תוסיף כדורי שמרים חיים, כי זה עלול לגרום לבעיות עקב צמיחת יתר של שמרי פוטנציאל כאשר מספר הזבובים הבוגרים הוא נמוך. 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת צאצאי הקלטות צריכה להיות מאורגנת כראוי לבדיקה ויזואלית קלה וניתוח יעיל עם חבילה סטטיסטית מתאימה (למשל JMP ממכון SAS) או כלים מבוססי אינטרנט בחינם (לדוגמא <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכולת התחרותית זרע. הוסף ספירות ומv2 v3. זבובים ממין נקבה שעוררו לא מוגבלים מאוד או צאצאים (למשל &lt;10), נפטרו במהלך ההליך, או שהיו רק בהצלחה inseminaטד על ידי אחד משני הגברים נחשבים לבלתי אינפורמטיבי ואינם נכלל בכל ניתוח סטטיסטי במורד הזרם (2.5.1 וטבלה 2). לחשב את ציון P 2 עבור כל נקבה אינפורמטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון האם קיימים הבדלים מובהקים סטטיסטי בערכי P 2 בקרב הגברים בהשוואה הניסיוניים. ניתן לעשות זאת באמצעות פרמטרים (HSD של טיוקי למשל) או שאינן פרמטריים בדיקות (למשל פלדה Dwass) בהתאם למספר גורמים, כולל הטיה של התפלגות ערכי P 2 ותלות בין השונות ואת הממוצע. השינוי זוויתי מיושם בדרך כלל לממדים כגון P 2 לפני השימוש במבחנים פרמטריים 31. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרשי שער מזווגים (אופציונלי). לכל סוג זכר ניסיוני, לחשב את מספר נקבות הזדווגו כפליים ואלה שהזדווגו רק עם הזכר הראשון (זכר ההתייחסות בassay העבירה והגברי הניסיוניים בדassay efense). באמצעות בדיקה המדויקת של פישר שני זנב (זמין <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">בhttp://www.langsrud.com/fisher.htm),</a> לקבוע אם קיימים הבדלים משמעותיים סטטיסטי בין שני הסוגים של גברים ניסיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחס מינים (אופציונלי). לכל זכר ניסיוני, השתמש במבחן צ&#39;י המרובע כדי לקבוע אם יחס מינים בצאצאים מכל נקבה סוטה מ1:1 הצפוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The descent of man and selection in relation to sex. , (1871).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).</li><li>Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , (1998).</li><li>Jones, B., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+sperm+competition+estimates.">Bayesian sperm competition estimates.</a> Genetics. 163, 1193-1199 (2003).</li><li>Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+and+sperm+displacement+in+natural+populations+of+Drosophila+melanogaster.">Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster.</a> Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).</li><li>Jonsson, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transfer,+storage,+displacement,+and+utilization+in+Drosophila+melanogaster.">Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 47, 1719-1736 (1962).</li><li>Boorman, E., Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+(ejaculate)+competition+in+Drosophila+melanogaster,+and+the+reproductive+value+of+females+to+males+in+relation+to+female+age+and+mating+status.">Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status.</a> Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).</li><li>Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. , 372-427 (1984).</li><li>Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+sperm+displacement+and+its+association+with+accessory+gland+protein+loci+in+Drosophila+melanogaster.">Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 139, 189-201 (1995).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+x+male+interactions+in+Drosophila+sperm+competition.">Female x male interactions in Drosophila sperm competition.</a> Science. 283, 217-220 (1999).</li><li>Civetta, A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+effects+on+male+and+female+components+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila.</a> Genet. Res. 75, 143-151 (2000).</li><li>Greenspan, L., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+variation+in+X+chromosome+male+reproductive+genes+and+sperm+competitive+ability+in+Drosophila+melanogaster.">Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster.</a> Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).</li><li>Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+male+accessory+gland+protein+Acp36DE+in+sperm+competition+in+Drosophila+melanogaster.">The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).</li><li>Yeh, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evidence+that+a+recently+evolved+Drosophila+sperm-specific+gene+boosts+sperm+competition.">Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).</li><li>Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+multiple+kinds+of+female+sperm-storage+organs+in+Drosophila.">Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila.</a> Evolution. 53, 1804-1822 (1999).</li><li>Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ejaculate-female+coevolution+in+Drosophila+mojavensis.">Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis.</a> Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).</li><li>Nonidez, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+phenomenon+of+reproduction+in+Drosophila.">The internal phenomenon of reproduction in Drosophila.</a> Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).</li><li>Miller, G. T., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-female+coevolution+in+Drosophila.">Sperm-female coevolution in Drosophila.</a> Science. 298, 1230-1233 (2002).</li><li>Manier, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+mechanisms+of+competitive+fertilization+success+in+Drosophila+melanogaster.">Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster.</a> Science. 328, 354-357 (2010).</li><li>Simmons, L., Siva-Jothy, M., Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , 826 (1998).</li><li>Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+remating,+sperm+competition+and+sexual+selection+in+Drosophila.">Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila.</a> Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).</li><li>Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+investigation+of+the+mating+system+of+Drosophila+hydei.">A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei.</a> Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).</li><li>Barbadilla, A., Quezada-D&#237;az, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+history+of+Drosophila+buzzatii.+XVII.+Double+mating+and+sperm+predominance.">The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance.</a> Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).</li><li>Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+sperm+competition+and+sperm+storage+in+Drosophila.">Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila.</a> Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).</li><li>Turner, M. E., Anderson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+predominance+among+Drosophila+pseudoobscura+karyotypes.">Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes.</a> Evolution. 38, 983-995 (1984).</li><li>Harshman, L. G., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inference+of+sperm+competition+from+broods+of+field-caught+Drosophila.">Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila.</a> Evolution. , 1334-1341 (1998).</li><li>Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+in+wild+Drosophila+melanogaster+revisited+by+microsatellite+analysis.">Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis.</a> Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).</li><li>Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+between+Drosophila+males+involves+both+displacement+and+incapacitation.">Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation.</a> Nature. 400, 449-452 (1999).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly+Pushing:+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics.">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics.</a> , (1997).</li><li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , (1994).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+genotypes+affect+sperm+displacement+in+Drosophila.">Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila.</a> Genetics. 149, 1487-1493 (1998).</li><li>Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontransitivity+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila.</a> Evolution. 54, 1030-1035 (2000).</li><li>Wigby, S., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition.">Sperm competition.</a> Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).</li><li>Pizzari, T., Parker, G. A., Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm biology: an evolutionary perspective. , 674 (2008).</li><li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminar+influences:+Drosophila+Acps+and+the+molecular+interplay+between+males+and+females+during+reproduction.">Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction.</a> Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).</li><li>Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sperm+competition+and+sperm+competition+avoidance+in+Drosophila+melanogaster.">Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

יש לנו תאר את עיצוב הניסיון להעריך הבדלים בתרומה היחסית של גנטי מובחן ד זכרים melanogaster לצאצאים בניסויים כפול 7,8 הזדווגות מבוקרות. זה נעשה בהקשר של גורם גנטי שערנו להשפיע על יכולת התחרותית זרע וזה כבר מאויר בתוך assay העבירה למרות שהליך דומה חל על assay ההגנה <...

מאז ג&#39;ף פרקר ציין השכיחות של תחרות זרע בחרקים והשלכותיה אבולוציוניים 2, גל של מחקרים בדרוזופילה ומינים אחרים ניסה לשפוך קצת אור על תופעה זו ברמות רבות ושונות. כמה דוגמאות לתחומי העניין היו הסקר של הווריאציה שלה באוכלוסיות טבעיות 9,10, הארכיטקטורה ורלוונטי של גורמים גנטיים שבסיס הגנטי שלה 11-14, ותפקידה בנהיגת אבולוציה משותף בין המינים 15,16. בד melanogaster נקבות, הקיבולת המוגבלת של איברי זרע האחסון מיוחדים, זוג spermatheca וקיבול זרע 6,17, תורם לתחרות של הזרע מזכרים שונים. כ -1,500 זרע מועבר במהלך הזדווגות לנקבה אבל רק ~ 500 ניתן לאכלס באיברים שהוזכרו 18,19. במעבדה, מבוקרת כפולה הזדווגות ההתנסותments מעורב זכר התייחסות ואחד או יותר מזכרים של עניין נעשה שימוש נרחב להערכת יכולת 7,8 זרע תחרותית. יכולת התחרותית זרע הערכה היא כמו היחס של צאצאים הוליד על ידי הזכר הניסיוני בניסויים כפול הזדווגות על הצאצאים המוחלט, כלומר, שגם מניסיוני והתייחסות לזכרים. יכולת התחרותית זרע מורכב משני מרכיבים, שכל אחד מהם הוערך בassay נפרד. ב assay העבירה, ביכולתו של הזרע הגברי הניסיוני כדי לעקור את הזרע מהזכר הראשון, כלומר ההתייחסות הגברית, מוערכת. לעומת זאת, בassay ההגנה, יכולתו של הזרע הגברי הניסיוני להתנגד עקירה או להפחית את ההצלחה ההפריה של הזרע גברי ההתייחסות מוערכת. בהתאם לסוג של assay, הגנה או התקפה, יכולת התחרותית זרע הערכה היא דרך עשרות P 1 או 2 P, בהתאמה. P1 ו-P 2 יכול לקחת ערכים בין 0 ו -1 בלבד. ערכי ביניים בדרך כלל מתפרשים כראיות עקיפות של זרע ערבוב, אשר טוען תרחיש פיסיולוגי מעורב תחרות זרע ישירה. בעקבות אותו הרציונל, ניתן לפרש את ערכים קיצוניים כהוכחה ליכולת התחרותית זרע ההפרש חזקה. מחקרים מוקדמים הראו כי P 2 בד melanogaster הוא מעל 0.8 הגדלת כמו הזמן שחלף בין שתי ההזדווגויות מאריכות 7. אותו עיצוב ניסיוני זה כבר נעשה שימוש במינים תסיסנית אחרים, P 2 להיות נתון נפוץ במחקרים כדי להעריך את יכולת זרע 20 התחרותית. עבור רוב המינים, את 2 ערכי P של הזנים שנבדקו הוא גבוהים יותר מאשר 0.6 21. עם זאת, מספר מנגנונים אחרים שאינם קשורים לתחרות הישירה בין הזרע של זכרים שונים יכולים להניב תוצאות זהות (ראה דיון). Dצאצאי istinguishing הוליד ידי הזכרים הראשונים או שני אפשרי באמצעות שימוש בסמני זיהוי בקלות. במחקרים מוקדמים, אחד מהזכרים היה מוקרן במינונים sublethal של, למשל, קרני ה-X כך שכמעט כל הביציות מופרות על ידי זרע מוקרן לא הצליחה לבקוע 7. בהמשך, מוטציות משינוי פיגמנטציה עין או צורת כנף היו הסמנים הנפוצים ביותר. דוגמאות ללשעבר הן מוטציות BW (חום) 9, cn (כינאבאר) 22 ו w (לבן) 23, ואילו את המוטציה (קרלי) 24 מקבילה Cy לסוג השני של פנוטיפים, כאשר חלק ממוטציות אלו כבר משולבים ב אותו אדם, למשל CN BW. במידה פחותה יותר, היו בשימוש allozymes 25 ומייקרו 26,27 עם דפוסי ירושה ידועים גם בשם. תכנון הניסוי לבדיקת הבדלים בהיכולת התחרותית זרע שתוארה כאן נובע למעשה זה של קלארק ואח&#39;. 9. תוצאות ניסויים אלה נגזרים מלתת מידע אך ורק על אבהות ההפרש של סוגי הגברים הניסיוניים תחת בדיקה. מבחני שגם הופכים את ההפרשה להבדלים לאחר הפריה בכושר 14,28 וטכניקות להדמיה זרע 24 לאפשר הבדלים ב1 P (או P 2) ציונים להתפרש כהבדלים ביכולת זרע. איור 1 מתאר את הרציונל של שניהם עבירה והמבחנים הבטחוני. כדי להמחיש את הלוגיסטיקה של התהליך, ניסוי בוצע בעבירת ד melanogaster 14 שיוסבר בפירוט. assay עבירה מסוים זה משמש לבדיקת השפעה מדידה של שרשרת multigene משפחת הזרע הספציפית dynein ביניים (SDIC) על יכולת התחרותית זרע. כל חברים של משפחת multigene זה מתגורר במקביל על כרומוזום X. הזכרים נוקאאוט נוצרו על ידי מחיקת אשכול SDIC. בגלל הקטע שנמחק כלל גם זרוע הקצרה הגן החיוני (SW) ומטרתו של המחקר הייתה להעריך את הרלוונטיות של SDIC, גברים שנשאו את מחיקת SDIC-SW חולצו על ידי עותק מהונדס של SW (סמלה כP {SW} , שגם נשא את גן כתב מיני לבן) בכרומוזום 2. צבע עיניים שימש כסמן גלוי לזיהוי אבהות. כל הזבובים היו ברקע לבן עם מוטציה למעט אלה מזן אורגון-R, אשר שמשו כזכרי התייחסות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

תחרות בין הזכרים conspecific לדישון הביציות היא אחד מהמנגנונים של ברירה מינית, כלומר בחירה שפועלת למקסם את מספר אירועי הזדווגות המצליחים ולא על הישרדות וכדאיות 1 מרחיבה את עוצמה. תחרות זרע מייצגת את התחרות בין זכרים לאחר הזדווגות עימו 2 הנקבה, שבזרע שלהם הם מקריים בזמן ובמרחב. תופעה זו כבר דווחה במינים רבים של צמחים ובעלי חיים 3. לדוגמה, שנלכד בטבע ד &#39; נקבות melanogaster מכילות בדרך כלל זרע 2-3 זכרים 4. הזרע מאוחסנים באיברים מיוחדים עם קיבולת אחסון מוגבלת, אשר עלול להוביל לתחרות הישירה של הזרע מזכרים שונים 2,5. השוואה בין היכולת התחרותית זרע של זכרים שונים של עניין (סוגים ניסיוניים גברים) שבוצע באמצעות ניסיוני כפולת הזדווגות מבוקרתTS במעבדה 6,7. בקצרה, נקבה אחת חשופה לשני זכרים שונים ברצף, גברים ניסיוניים אחד ואחת ממין זכר התייחסות צולבת הזדווגות. אותו ערכת ההזדווגות לאחר מכן ואחרי השימוש בסוגי גברים ניסיוניים אחרים וכך להקל על ההשוואה העקיפה של היכולת התחרותית של הזרע שלהם באמצעות התייחסות משותפת. חלק קטן מאנשי אביהם היו הזכרים הניסיוניים והתייחסות מזוהה באמצעות סמנים, המאפשר אחד כדי להעריך את היכולת התחרותית זרע באמצעות ביטויים מתמטיים פשוטים 7,8. בנוסף, ניתן להעריך את היכולת התחרותית זרע בשני תרחישים שונים, תלויים אם הזכר הניסיוני הוא שני או ראשון להזדווג (עבירה וassay הגנה, בהתאמה) 9, שהנחה הוא שהוא משקף את יכולת תכונות שונות. כאן, אנו מתארים את הגישה שעוזרת לחקור את תפקידם של גורמים גנטיים שונים שעומדים בבסיס לא putativelyהוא התופעה של כושר תחרות זרע בד melanogaster.

טבלה 2 מסכמת כמה מאפיינים בולטים של שני ניסויי עבירה (מבחני 1 ו -2) שבו ד זכרים ניסיוניים melanogaster עם ובלי (סוג I ו-II, בהתאמה) אשכול SDIC תפקודי הם בהשוואה 14. לאחר שלקח בחשבון מקרים שונים בהם נתקל עם כמה חזרות, 58-83% מהנשים נמצאו להיות אינפורמטיבי ול?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila at JoVE.com

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

יכולת התחרותית ההפרש בין זרע<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גברים עם גנוטיפים שונים ניתן לקביעה באמצעות ניסויים כפולי הזדווגות. כל אחד מניסויים אלו כרוך אחד הזכרים של עניין והתייחסות גברית. סמנים לזיהוי בקלות בצאצאים לאפשר היסק של חלק קטן מאנשי אביהם היה כל זכר.

הבדלי שומה ביכולת תחרותית בזרע<em&gt; דרוזופילה</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.5K Views.  University of California, Irvine. יכולת התחרותית ההפרש בין זרע דרוזופילה גברים עם גנוטיפים שונים ניתן לקביעה באמצעות ניסויים כפולי הזדווגות. כל אחד מניסויים אלו כרוך אחד הזכרים של עניין והתייחסות גברית. סמנים לזיהוי בקלות בצאצאים לאפשר היסק של חלק קטן מאנשי אביהם היה כל זכר.

Video: Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

הקרנת מבחני עבור הערכה של השפעות על Ca2 +תפוקה בינונית-איתות ותגובה Acrosome זרע אנושי

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

הערכת היכולת הייחודית ביותר לגיל מיוחד למבוגרים דרוזופילה מלאנוטציטים באמצעות שיטת בVivo פגוציטוזה

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...