우리는 촬영 지원을위한 원고와 베티 Cowgill의 중요한 읽기 산티아고 레즈 감사합니다. 우리는 또한 자신의 중요한 의견을 익명의 검토를 부탁드립니다. 이 작품은 델라웨어 대학의 연구 기금에 의해 지원됩니다.

1. 프로타민 황산염의 제조 (PS) 요리를 코팅 <ol><li> 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 탈 이온수, 증류수 (DDH 2 O) 50 ㎖에 PS 0.5 g을 첨가하여 프로타민 설페이트 (PS)의 1 % 용액을 제조 하였다. PS의 완전한 해체를 확인하기 위해 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 벤치 통에 빠른 속도로 잘 흔들어. 이 솔루션은 (완전히 각 사용하기 전에 젤 같은 침전물을 분해해야합니다) 3 최소한 3 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 60mm X 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시의 소매를 가지고 벤치에 모두 뚜껑과 바닥을 배치. </li><li> 최소 2 분 동안두고, 표면을 커버하기에 충분한 각 접시에 1 %의 PS 솔루션을 (모두 바닥과 뚜껑을 사용할 수 있습니다) 붓는다. 4 ℃에서 저장 될 때 나머지의 PS 솔루션을 3 개월 이내에 여러 번 재사용 할 수 있습니다 </li><li> 장소 증류수 DH (2 O)로 가득 비커에 요리를 PS 처리. 에 dH보다 2 O를 실행에서 비커를 남겨 이상10 분. </li><li> PS-코팅 된 요리는 저장을 위해 즉시 또는 건조한 공기 사용할 수 있습니다. 먼지 축적을 방지하기 위해 그들을 커버. 그들은 1 달 3 상온에서 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 성게 배우자를 얻고 미세 주입을위한 PS-코팅 접시에 계란을 무력화 <ol><li> 배우자 3 (그림 2)를 출시 평활근의 수축을 유도하는 동요 또는 0.5 %의 KCl 최대 1 ㎖의 intracoelomic 주사 알 성게. </li><li> 동물 수컷이라면, 백색 정자으로 나타낸 바와 같이, 1.5 ㎖의 튜브에 동물의 표면으로부터 정자 건조수록. 드라이 정자는 생물학적 기능의 큰 손실없이 일주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 동물 인해 노른자 내용으로 노란색으로 표시된 바와 같이 여성, 바다 물이 가득 비커에 gonopores 침지하여 배우자를 수집하는 경우. 계란 gonopores에서 발표 및 중력에 의해 아래로 정착 될 것입니다. &lt;/ 리&gt; <li> 이물질 등 80 μm의 나일론 필터 메쉬를 사용하여 동물의 등뼈로 계란을 필터링합니다. 계란이 산란 후 5-7 시간 내에서 사용하는 경우 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. </li><li> 계란을 Dejelly : <ol><li> 계란의 약 1 ㎖에 산성 바다 물 100 ㎖를 준비합니다. 5.1-5.2 pH가 8.0에서 해수의 pH를 조정하는 0.5 M 구연산을 사용합니다. 산도가 너무 낮은 수정을 감소하고 pH가 너무 높은 계란은 PS 코팅 된 플레이트에 부착 할 수 없습니다. </li><li> 산성 바다 물에 계란 (이하 1 ㎖)를 추가하고 계란은 10 분 동안 얼음에 정착 할 수 있습니다. 대안 적으로, 젤리 코트의 제거는 치료 중에 계란의 부드러운 소용돌이에 의해 촉진 될 수있다. 하나는 3 ~ 4 분에서 효과적으로 dejelly이 방법을 S.의 purpuratus 계란을 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게, 산성 바다 물을 부어 신선한 바다 물을 추가하고 계란이 다시 얼음에 정착 할 수 있습니다. Dejellied 계란 수정 문제없이 최대 6 시간 동안 얼음에 저장할 수 있습니다 </li></ol></리&gt; </ol> 3. 계란에게 행 <ol><li> DDH 2 O의 10 ㎖에 3-AT의 0.84 g을 용해하여 3 aminotriazole (3-AT, MW = 84.08)의 1 M 주식 솔루션을 준비합니다 이 솔루션은 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> prechilled 바다의 물 50 ㎖에 1 M 주식 솔루션의 50 μl를 추가하여 3-AT의 1 ㎜ 작업 솔루션을 준비합니다. 얼음에 솔루션을 보관하십시오. </li><li> 계란의 부드러운 처리를 위해 입 피펫 (그림 3)를 준비 : <ol><li> 피펫 팁을 수동으로 유리 마이크로 피펫 (100 × 외경 1.09 mm)에서 당겨진다. 불꽃에 두 손으로 마이크로 피펫을 잡고. 유리가 녹기 시작으로, 조심스럽게 반대 방향으로 피펫의 끝을 당겨. </li><li> 하나는 파라 필름으로 단단히 밀봉 플라스틱 튜브 (ID 1.14 mm)에 피펫을 뽑아 연결합니다. 튜브의 길이는 약 50~70센티미터해야한다. </li><li> 행 유리관에 튜브의 대향 단부에서 멸균 여과 P20 또는 P200 팁을 삽입마우스 피스로 사용할 수. </li><li> 팁의 직경을 조절하기 위해 가위로 유리 마이크로 피펫의 끝을 클립. 최적의 직경은 약간 달걀 (80 μM)의 직경을 초과한다. </li></ol></li><li> 각 PS-코팅 접시 (바닥 또는 뚜껑)에 1 mM의 3-AT 바다 물 4 ㎖를 붓는다. </li><li> 입 피펫을 입에 P20/P200 팁을 넣어 이빨로 고정. 계란 대기음하려면 먼저 해수 소량 대기음. 종래 계란로드에 액체의 열을 구비함으로써, 하나의 입 피펫 팅 기법을 통해 최대 제어 할 것이다. </li><li> 계란 근처에 마이크로 피펫 팁을 배치하고 부드럽게 피펫에 계란 수백에서 대기음. 유리 마이크로 피펫에서 계란을 제한 할 것. </li><li> 행 직선의 끝을 이동하는 동안 부드럽게 입 피펫 그들을 불어 접시에 직선으로 계란을 dejellied. 수정 문제로 인해 P 발생할 수 있기 때문에, 바로 주사하기 전에 계란을 행3-AT 바다 물 3에 대한 노출을 rolonged. 또한, PS와 같은 양이온 성 접착제는 계란에 독성이있을 수 있고, 수정 봉투가 제거 된 경우에는 특히 오랜 기간 동안 이러한 시약으로 배아를 노출하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 저었다 계란의 라인 근처 접시에 스크래치를 확인합니다. 이러한 스크래치는 필요에 따라 용액의 유량을 조정하는 주사 바늘을 중단하는 것이 중요 할 것이다. 또한, 스크래치가 접시에 3-AT 바다 물을 붓는 전에 할 수있다. </li></ol> 4. 성게의 수정란 미세 주입 <ol><li> 미세 주입 스테이션의 전원을 켭니다. 여기에서 우리는 FemtoJet 분사 시스템의 사용을 설명한다. </li><li> 바늘 풀러를 사용하여 주입 모세 혈관을 당깁니다. 좋은 바늘의 일례가도 4에 도시된다. 참고 : RNA 주입은, 주입 모세 혈관 RNAase 오염 (31)를 방지하기 위해 전처리되어야한다 : <ol><li> 50 ML 원뿔에 주입 모세 혈관을 놓고튜브 및 여과 메탄올 / 염산 (9:1)로 50 ㎖를 추가합니다. 잘 흔들어 10 시간 이상 더 이상 하룻밤 둡니다. </li><li> 메탄올 / 염산을 붓고 모세 혈관 같은 튜브에 여과 메탄올로 2 배 린스. </li><li> 극력 메탄올 흘려 메탄올 완전한 제거를 보장하기 위해 밤새 모세관을 냉동 건조. </li></ol></li><li> 조심스럽게 바늘로드 홀더에 바늘 모세관을 탑재하고 microloader 팁을 사용하여 시료 용액의 &lt;0.5 μL로로드합니다. 샘플 용액은 보통 주입 재료 (3)에 따라 20 %의 글리세롤을 포함한다. </li><li> 현미경 단계 (접안 렌즈를 통해 볼 때 계란은 수직으로 정렬되어야한다)에 저었다 계란 요리를 놓고 계란에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 정중 마이크로 인젝션 니들 홀더 상에 적재 니들 마운트 필드의 중앙에 집중된 완벽 팁을 갖도록 바늘의 위치를​​ 조정한다. </li><li> 최대 압력 FO을 적용 버튼을 우울R 바늘 청소. 해결 방법은 바늘에서 나오는 것이다. 필요할 경우 압력을 조절 : 사출 압력은 약 1 / 3의 사출 압력 보정 압력, 90-360 고전력 증폭기의 범위에 있어야한다. </li><li> 미 수정 난자에 주입하여 솔루션의 흐름을 조절합니다. 조이스틱 미세 조작기를 사용하여 난자에 주사 바늘의 선단을 연출. 바늘 항목을 촉진 이러한 스크류 드라이버와 같은 단단한 물체와 무대의 부드러운 도청에 의해 약간의 떨림을 만들 수 있습니다. 계란 내부에 형성 주입 러스 (그림 5)을 볼 수 있어야합니다. </li><li> 사출 알약이 표시되지 않는 경우, 약간, 계란 위의 바늘의 끝을 제기 접시에 스크래치를 찾아 필드의 중간에 위치하도록 조정합니다. 부드럽게 주사 바늘의 끝을 깰 수있는 스크래치 마크에 바늘 끝을 누릅니다. 사출 알약은 t 1 / 5을 초과하지 않도록하기 위해 주입 및 보상 압력을 조절계란 (1-2시)의 그 직경. </li><li> 사출 알약이 교정되면, 희석 정자 (1:1,000) 또는 정자의 1-2 μl를 추가하여 계란을 비옥. 계란의 행을 쫓아 내기 방지하기 위해주의 깊게 잘 섞는다. </li><li> 수정 봉투 (그림 5)으로 표시되기 직후 주사를 시작합니다. 스테이지 컨트롤러를 사용하여 저어 달걀의 선을 따라 이동하고 조이스틱 micromanipulator에 의해 제어되는 바늘을 파고하여 가능한 많은 수정란을 주입. </li><li> 10-15 분 후, 새롭게 수정란 경화 될 것이며, 더 이상 분사 될 수 없다. 무대에서 접시를 제거하고 조심스럽게 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 3-AT 바다 물에 정자를 대기음. </li><li> 접합자가 건조하게하지 마십시오. 빨리 요리를 충당하기 위해 신선한 prechilled 바다 물을 추가합니다. 15 ° C에서 배아를 품어 </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 그 밖의 충돌 선언하지 않습니다.

미세 주입은 DNA, mRNA의, 재조합 단백질, 기능의 손실, 계란, 배아, 다양한 생물 1-7의 세포로 기능 시약, 염료 및 그 조합의 이득 등의 다양한 트리트먼트를 제공하는 강력한 기술이다. 미세 주입 실험을 설계 할 경우에는 몇 가지 고려 사항을 염두에 보관해야합니다. 그것은 전달 처리 및 주입량의 용해성을 고려하는 것이 중요하다. 미세 주입 용액은 심지어 약간 침전?...

효율적이고 재생 가능한 치료 배달 연구원의 주요 방법론적인 문제 중 하나입니다. 여러 가지 방법이 일시적으로 계란, 배아 세포로 치료 솔루션을 제공하기 위해 설립되었습니다. 이러한 방법은 1, 2, 리포 펙 (막 치료 함유 리포좀의 융합을 통해 배달) 1, 미세 충격 1 (DNA가 마이크론에 침전 (짧은 전기 펄스를 사용하여 막에서 생성 과도 모공 기준) 일렉트로 포함 크기의 금속 후 고속으로 세포에 침투하는 데 사용되는 입자) 및 전달 (바이러스가 도입 유전자의 전달 수단으로 사용된다.) 이때, 마이크로 인젝션 시약은 최소한 100 %의 효율로 임의의 솔루션을 제공하는 장점을 보유하는 유일한 방법이다. 또한, 단일 주입 용액 처리의 복잡한 칵테일로 구성 될 수있다. 이 방법은 성공적으로 사용되어왔다LY는 성게 3,4, 얼룩말 물고기 5, 마우스, 6, 7, 개구리, 소 8뿐만 아니라 조직 배양 9 단일 세포와 같은 많은 종에서 계란과 배아를 microinject. 나중에 발달 단계에서 단일 할구 주사는 10-12를 실시하고 있습니다. microinjections의 현재의 방법은 처음 Hiramoto 10에 의해 설명 된 감압 주입법에 기반하지만, 실력이 프로세스의 최적화를 향해 제되었다. 우수한 미세 주입 기술은 다른 11에 설명되어 있고, 여기에 우리가 현재 성게 (Strongylocentrotus의 purpuratus) 새로 수정 된 알을 microinject하는 데 사용되는 특정 방법 중 하나를 설명합니다. 세기 이상, 성게 가치있는 실험 모델 (15, 16)하고있다. 성게는 진화 적으로 밀접하게 (우리 포함) 척색 동물과 분석에 관련된자신의 게놈은 인간의 17과 같은 모든 주요 유전자 가족을 포함하는 것으로 나타났습니다. 그들은 기적으로 쉽게 조작 할 수있는 투명 배아 개발의 다수 생산. 모델 생물로 성게를 사용하여, 성게 사회는 우리의 수정 과정의 이해 18-21, 세포 생물학적 과정 22 ~ 24, 및 유전자 조절 네트워크 (GRNs) 25 ~ 28에 기여하고있다. 성게의 수정란에 미세 주입 몇 가지 단계가 필요합니다. 첫째, 계란은 사전 (아래에 설명) 주사에 고정 될 필요가있다. 미세 주입 요리는 음으로 대전 된 계란 3을 준수 할 수있는 양으로 대전 된 표면을 생성 프로타민 황산 (PS)로 코팅되어있다. 계란은 천연 해수 또는 인공 해수 (산도 8.0)의 두 세척 한 다음, 10 분 동안 산성 바닷물에서 배양 (산도 5.15)에 의해 dejellied됩니다. dejellied 계란은 신중하게 직선으로 저어됩니다시비 (29)의 결과로 계란의 피질에서 과립 분비 ovoperoxidase의 활성을 억제하는 데 필요한 1 내지 3mm aminotriazole-(3-AT)의 존재하에 PS 코팅 접시의 중앙. 이 단계는 시비 포락선의 경화를 방지하고, 마이크로 인젝션 니들 진입을 용이하게하기 위해 중요하다. 1 mM의 3-AT에 대한 대안으로, 10 mM의 paraminobenzoic 산 (PABA)이 사용될 수있다. 주사액 전문 마이크로 로딩 피펫 팁을 사용하는 마이크로 인젝션 용 바늘에로드 micromanipulator에 압력 부에 부착 된 홀더 (도 1)에 장착된다. 각각의 바늘은 별도의 일에 대한 여러 실험에서 각각의 접합자를 microinject하는 데 사용할 수 있습니다. 접합자가 강화 될 때까지 미세 주입은 15 분 동안 수행 할 수 있습니다. 접합자는 다음 15 ℃에서 바다 물을 배양 세척 배아 blastula 단계 부화에 도달하면, 그들은 그다지의 구성 요소를 소화 부화 효소를 해제tilization 봉투 (30)과 그들을 자연스럽게 PS-코팅 접시에서 분리 할 수 있습니다. 필요한 경우, 배아 부드럽게 부드럽게 배아에 해수를 불어 입 피펫 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시로부터 분리 될 수있다. 설명 된 방법은 다운 스트림 분석을위한 높은 처리량을 제공하는 방법, 하나의 접시 100-400 새롭게 수정란의 효율적이고 신뢰성있는 미세 주입을 가능하게한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="794">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:211px;">14673-043</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope Axiovert 40C</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:211px;">4109431007990000</td>
			<td>Injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:211px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;">Load injection solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nylon filter mesh 80 &#956;m</td>
			<td style="width:200px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:211px;">03-80-37</td>
			<td style="width:167px;">Filter eggs to get rid of debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">02707432 or 02707430</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13 374 12</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:200px;">Intramedic</td>
			<td style="width:211px;">PE-160</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protamine sulfate</td>
			<td style="width:200px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:211px;">194729</td>
			<td style="width:167px;">Attach dejellied eggs to injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea urchins S. purpuratus</td>
			<td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td>
			<td style="width:211px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea water</td>
			<td style="width:200px;">any pet store</td>
			<td style="width:211px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">0875713A</td>
			<td style="width:167px;">Injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9124</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9212</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transfer pipettes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13-711-9AM</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical needle puller </td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">PC-10</td>
			<td>Pull injection needles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput microinjections of sea urchin zygotes

세포 및 배아로 마이크로 인젝션은 생물학적 과정의 광범위한 연구하는 데 사용되는 일반적인 기술이다. 이 방법에서는 처리 액의 소량의 개별 물리적 고정화 세포 또는 배아를 주입하는 데 사용되는 마이크로 인젝션 니들에로드된다. 높은 처리량 전달을 위해이 절차를 수행하려면 초기 교육의 필요성에도 불구하고, 미세 주입은 최대의 효율성과 세포, 계란 또는 태아에 (샘플의 복잡한 혼합물을 포함한다) 치료 솔루션의 다양한 재현 배달을 제공합니다. microinjections에 응용 프로그램은 DNA의 구조, mRNA를, 재조합 단백질, 기능의 증가, 기능 시약의 손실 전달 있습니다. 형광 또는 비색 염료 인스턴트 효율적인 전달 시각화뿐만 아니라 전달되는 용액의 양의 신뢰성 정상화하기위한 도구를 사용하는 주입 용액에 첨가된다. 한 방법은 100 ~ 400 성게 Z의 미세 주입을 가능하게10 ~ 15 분 이내 ygotes.

GFP 및 mCherry 기자의 구조는 전사 새로 수정란에 미세 주입 체외에 있었다. 배아는 (blastula 단계까지) 24 시간 동안 15 ° C에서 배양 및 혈구 관찰자 Z1 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. 기자 구조의 주입은 발달 결함으로 (그림 6)를지도하지 않았다. 형광 신호의 정량화를 들어, 이미지 수집은 최대한 형광 픽셀 (그림 6D-F)를 캡처하는 낮은 배율 (100X)에서 수행 하였다....

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High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

미세 주입 계란, 배아, 다양한 종류의 세포로 DNA의 구조, mRNA를, 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 다른 치료를 제공하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K 조회수.  University of Delaware.  미세 주입 계란, 배아, 다양한 종류의 세포로 DNA의 구조, mRNA를, 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 다른 치료를 제공하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. 

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

연구

생물학

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

의 흐름 세포 계측법 기반 정화<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

의 미세 주입을위한 방법<em&gt; Patiria의 minata</em&gt; 접합자

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...