The work was supported by grants from the Universit&#233; catholique de Louvain (Action de recherch&#233; concert&#233;es) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from T&#233;l&#233;vie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation &#224; la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).

Mäuse wurden gemäß den Prinzipien der Labortierpflege von der University Animal Welfare Committee angehoben und behandelt. Alle Verfahren und Protokolle wurden von diesem Ausschuss genehmigt. 1. Beschichtung von Kunststoff-Mikroskopie Kultur Chambers HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube. Die zwei Arten von Beschichtungs funktionell äquivalent sind. <ol><li> Coat Kunststoff Kulturkammern mit Fibronektin einen Tag vor der Isolierung von Schilddrüsengewebe: <ol><li> Verdünnte sterile Fibronektin zu einer 50 ug / ml Endkonzentration in M199-Medium mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 0,25 ug / ml Fungizon und 2 mM Glutamin, 12 ergänzt. </li><li> Die Vertiefungen mit 200 ul verdünnt Fibronektin und Inkubation über Nacht in einem 4 ° C Kühlschrank. </li><li> Am Tag der Präparation absaugen Fibronektin, spülen Sie die Vertiefungen einmal mit M199 und fügen ein minimales Volumen von 200 ul M199 mit Antibiotika, Glutamin und 10% fötalem Kälberserum ergänzt. </li><li> Lassen Sie die beschichtete Kammern in den Inkubator, bis bereit, die Explantate plattieren. </li></ol></li><li> Coat Kunststoff Kulturkammern mit Typ-I-Kollagen 2 h vor der Isolierung von Schilddrüsengewebe: <ol><li> Verdünnte sterile Kollagen Typ I zu 50 ug / ml Endkonzentration in 10 mM HCl. HINWEIS: Halten Kollagen-Stammlösung auf Eis. </li><li> Die Vertiefungen mit 200 ul verdünnt Kollagen Typ I und Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Saugen Sie den Typ-I-Kollagen-Lösung, spülen Sie die Vertiefungen einmal mit M199 und fügen Sie ein Mindestvolumen von 200 ul M199 mit Antibiotika, Glutamin und 10% fetales Kälberserum. </li><li> Lassen Sie die beschichtete Kammern in den Inkubator, bis bereit, die Explantate plattieren. </li></ol></li></ol> 2. Präparation der Schilddrüse Anlagen haltigen Gewebe (E12.5) oder Schilddrüsenlappen (E13.5-e14.5) HINWEIS: Verwenden Sie saubere Präparationswerkzeuge und Petri / Kulturplatten. Die allgemeinen Schritte und Einschnitte unten beschrieben sind bei E12.5 und E14.5 Embryonen. <ol><li> Sacrifice timed-schwangeren weiblichen Mäusen in der gewünschten embryonalen (e) Tag (von E12.5 bis E14.5) lösen und die Gebärmutter mit Präparierinstrumenten. </li><li> Legen Sie die seziert Gebärmutter in einer 10 cm-Platte mit HBSS. </li><li> Halten Sie ein Ende der Gebärmutter mit einer Pinzette und öffnen die Gebärmutter mit einer kleinen Schere schrittweise befreien alle Embryonen. </li><li> Trennen Sie die Embryonen aus der Plazenta mit der Schere und die Übertragung der Embryonen mit ihren extra Membranen in eine neue 10 cm-Platte mit HBSS. </li><li> Entfernen Sie den Dottersack und Amnion. HINWEIS: Ab diesem Punkt arbeiten unter einem Stereomikroskop mit Durchleuchtung von unten; zunehmender Vergrößerung mit Dissektion Schritte. Verwenden Wolfram Nadeln in Glaskapillaren als Sezieren Werkzeuge. </li><li> Mit den Nadeln wieein Messer und Gabel, entfernen Sie den oberen Teil des Kopfes, einschließlich der Oberkiefer und den Ohren (Abbildung 1A, entlang einer Schnitt). </li><li> Halten Sie den Embryo auf den Rücken und entfernen Sie zunächst eine zusätzliche Stück des Neuralrohr (1A, zusammen geschnitten b), dann wird der untere Teil des Embryos, nur unter den vorderen Gliedmaßen und über dem Herzen (Abbildung 1B). </li><li> Übertragen Sie die Scheibe, die den Embryo Zunge (um das Gewebe zu orientieren)-Hals-Bereich in eine neue 10 cm-Platte mit HBSS. </li><li> Entfernen Sie das Neuralrohr und Gewebe hinter der Speiseröhre / Luftröhre (1C, entlang einer Schnitt). </li><li> Sanft Abschnitt der Gewebeschnitt entlang beider Seiten der Zunge (1C, entlang b und b &#39;schneiden). </li><li> Suchen Sie die Speiseröhre und Luftröhre, in der Verlängerung der Zunge, und sezieren entfernt die Zunge, so dass die Ary-Schwellung (1D, zusammen ein Schnitt), und das Gewebe auf Both Seiten der Speiseröhre / Luftröhre (1D, entlang b und b &#39;schneiden). </li><li> Entfernen Sie die Speiseröhre, die Luftröhre und legen mit ihrer Bauchseite nach oben ein. </li><li> Sezieren die unerwünschten Geweben wie der Thymus (Fig. 1E) und alle seitlich zu den Schlundbogenarterien Gewebe. Für E13.5 E14.5 Embryonen oder, visualisieren die Schilddrüsenlappen auf jeder Seite der Luftröhre (1F, rot gestrichelte Linien) und weiter sezieren die Lappen aus der Luftröhre. </li><li> Übertragen Sie die Luftröhre getrennt E12.5 Region oder die E13.5-E14.5 Schilddrüsenlappen in eine 35 mm Kulturplatte, die vorgewärmten M199-Medium mit Antibiotika, Glutamin und 10% fetales Kälberserum. Übertragen Explantate mit einem feuchtFilterSpitze auf einem P-200-Mikropipette. Für E12.5 Explantate, schneiden Sie das Ende der Spitze, um die Öffnung zu erweitern. HINWEIS: Routinemäßig und wenn Embryonen haben den gleichen Genotyp, führen Sie die Schritte 6 und 7 auf alle Embryonen, dien 9-11, und schließlich 12 und 13. </li></ol> 3. Überzug und Kultur der Schilddrüse Explantate <ol><li> Waschen der Explantate durch aufeinanderfolgende Übertragung in drei Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen, die 1 ml vorgewärmtes Kulturmedium (M199 = mit Antibiotika, Glutamin und 10% fötalem Kälberserum). </li><li> Überzug von Schilddrüsenlappen auf beschichteten Kunststoffmikroskopie Kulturkammern: <ol><li> Saugen M199 Kulturmedium aus den beschichteten Kammern. </li><li> Vorsichtig, übertragen Sie die Schilddrüse Explantate in die Kulturkammern mit einer Mikropipette und Filterspitzen. Legen Sie eine Explantation in der Mitte der jeweiligen Kammer. </li><li> Entfernen überschüssigen Medium und legen die Kulturkammer in einem Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) 2 Stunden lang die Explantate heften sich an die Matrix zu lassen. </li><li> Vorsichtig, um jede weitere 200 bis 300 ul vorgewärmtes Kulturmedium auch. </li><li> Inkubieren einer Langzeitkultur in der Gewebekultur-Inkubator. </li></ol></li><li> Plating of Luftröhre Region oder Schilddrüsenlappen auf semiporöse Filter: <ol><li> Bitte geben Sie die Anzahl der Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 330 ul vorgewärmtes Kulturmedium erforderlich. </li><li> Platz Filter (zB 0,4 um Millipore-Filter) auf dem Medium, kümmert sich um das Einfangen von Luftblasen unter der Kultur-Filter zu vermeiden. </li><li> Vorsichtig mit einer Mikropipette und Filterspitzen, übertragen Sie die Schilddrüse Explantate mit einem minimalen Volumen des Mediums auf die Mitte der Filter (maximal 4/filter). </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Medium und Raum aus den Explantaten mit einer Wolfram-Nadel. </li><li> Inkubieren einer Langzeitkultur in der Gewebekultur-Inkubator. HINWEIS: Ändern Kulturmedium jeden zweiten Tag unter der Sterilbank. Kultur die Explantate bis zu 7 Tage. </li></ol></li></ol> 4. Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Färbung Protokoll für Schilddrüsen-Explantate Verdrängen Explantate auf Filter gewachsen (nach Schritt 2 unten) unter Verwendung von Wolfram Nadeln oderfeinen Pinzette und Transfer in einer 24-Well-Platte für alle Schritte mit Ausnahme des primären (Schritt 5) und sekundäre (Schritt 7) Antikörperinkubationen (96-Well-Platte). Für haft Explantate auf Kunststoffmikroskopie Kammern kultiviert, führen Sie alle Schritte in den Kulturräumen. <ol><li> Saugen M199 Kulturmedium und fixieren Sie die Explantation mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min (500 ul in 24-Well-Schale und 300 ul in der Mikroskopie Dias). </li><li> Waschen 2x 10 min in Tris-gepufferter Salzlösung mit Triton (TBST, 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) bei RT. </li><li> Verarbeiten Sie die Explantate sofort oder bei -20 ° C HINWEIS: Für die langfristige Lagerung bei -20 ° C, trocknen die Explantate in Methanol mit allmählich zunehmender Methanolkonzentration in TBST bis 100% Methanol zu erreichen. Wenn Sie bereit sind, mit der Immunfärbung (Schritt 4) weiter, Rehydrierung der Explantate indem allmählich TBST zu Methanol. </li><li> TBST Ersetzen mit der Blockierungslösung (10% normalem Ziegenserum in TBST) Und Inkubation auf einem Meer-Säge Wippe für 30-60 min bei RT. </li><li> Primäre Antikörper verdünnt in Blocking-Lösung (100-200 ul pro Bedingung). Übertragen Sie die &quot;Filter&quot;-Explantate von einer 24-Well-Platte auf eine 96-Well-Platte. Explantate Inkubation mit den primären Antikörpern auf einem Meer-Säge Wippe über Nacht bei 4 ° C </li><li> Am nächsten Tag, verwerfen Sie den primären Antikörperlösung, übertragen Sie die &quot;Filter&quot; Explantate zurück in eine 24-Well-Platte, und waschen Sie mindestens fünf Mal mit TBST auf einem Meer-Säge Rocker für jeden bei RT 45-60 min. </li><li> Verdünnen sekundären Antikörper (zB Ziege anti-X-Alexa Fluor bei 1:2000 Verdünnung) in TBST mit 1% normalem Ziegenserum und Inkubation der Explantate mit dieser Verdünnung über Nacht auf einem Meer-Säge Wippe bei 4 ° C und in der Dunkelheit. Für die Kerngegenfärbung umfassen 1 ug / ml Bisbenzimid (Hoechst) zusammen mit dem sekundären Antikörper-Lösung. </li><li> Am nächsten Tag, entsorgen Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen 5x mit TBST auf einem Meer-SägeWippe für jeden bei RT 45-60 min. In den Waschanlagen, halten die Explantate in der Dunkelheit. </li><li> Führen Sie eine zusätzliche Wasch in TBST vorsichtiges Schwenken über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Postfix die immun Explantate in 4% PFA bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Waschen Sie 2x 10 min mit TBST. </li><li> Transfer der Explantate allmählich entweder in 100% Methanol für die langfristige Lagerung bei -20 ° C oder unmittelbar zu analysieren. Für Explantate auf Filtern kultiviert und in einer 24-Well-Platte immun, Transfer in einer Kammer Mikroskopie (zB LabTek oder ibidi) mit TBST oder besser Leuchtstoffmontagemedium vor der Analyse mit einem Multiphotonen-oder konfokalen Mikroskop. </li></ol> 5. Extraktion von RNA aus Schilddrüse Arbeiten Sie in einem RNase-freien Umgebung. Verwenden Sie daher Nukleinsäure und nucleasefreiem Pipettenspitzen und reinigen sowohl Bank und Ausrüstung von Verunreinigungen und RNasen. Dieses Protokoll auf Phenol / Chloroform-Basis, führen Sie den ersten Schritts (1 bis 7) unter einer chemischen Haube. <ol><li> Homogenisieren ein Schilddrüsen Explantat oder zwei Schilddrüsenlappen mit 300 ul RNA-Extraktionslösung mit einem Einweg-Stößel für 1,5-ml-Tube. Zwischen Proben, waschen Sie den Stößel in 2% SDS, dann Wasser, dann mit Ethanol. </li><li> In weiteren 100 ul RNA-Extraktionslösung, Vortex 10 Sek. und Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Vortex für 30 Sekunden und mit 20 ng tRNA zu jeder Probe. </li><li> Vortex für 1 min und fügen Sie 80 ul Chloroform. </li><li> Vortex kräftig für 30 Sekunden inkubiert und 15 min bei RT. </li><li> Spin für 15 min bei 19.000 × g in einer gekühlten (4 º C) zentrifugiert. </li><li> Übertragen Sie sorgfältig die farblose obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen mit 20 ug Glykogen als Mitfällungsmittel. </li><li> Vortex und mit 200 ul von 100% Isopropanol Alkohol. </li><li> Vortex kräftig für 15-30 sec und lassen RNA-Präzipitat bei -20 º C für 2-3 Stunden oder bei -80 ° C für 1 Stunde. </li><li> Spin für 30 min bei 19.000× g bei 4 ° C, und beseitigen Überstand. </li><li> Waschen des Pellets mit 450 ul kaltem 75% Ethanol und Wirbel um das Pellet zu lösen. </li><li> Spin für 10 min bei 19.000 × g bei 4 ° C, und beseitigen Überstand. </li><li> Trocknen des Pellets unter der Haube 5 min. </li><li> Das Pellet mit 10 ul RNase-freies Wasser und Inkubation 10 min bei RT. </li><li> Assay-RNA-Konzentration, bei -80 ° C oder Reverse Transkription für die Genexpressionsanalyse. </li></ol>

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	<li>Colin, I. M., Denef, J. -. F., Lengel&#233;, B., Many, M. -. C., G&#233;rard, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+the+cell+biology+of+thyroid+angiofollicular+units.">Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units.</a> Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).</li><li>Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+mouse+thyroid+embryonic+vessel+contacts+and+parenchymal+growth+pattern+during+specification+budding,+migration,+and+lobulation.">The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation.</a> Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).</li><li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+thyroid+gland.">Morphogenesis of the thyroid gland.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).</li><li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetics+of+early+thyroid+development.">Morphogenetics of early thyroid development.</a> J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).</li><li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+development+and+its+disorders+genetics+and+molecular+mechanisms.">Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms.</a> Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).</li><li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+factors+in+thyroid+gland+development:+an+update.">Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update.</a> Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).</li><li>Hick, A. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+epithelial+paracrine+interactions+during+thyroid+development+govern+follicular+organization+and+C-cells+differentiation.">Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation.</a> Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).</li><li>Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+integration+of+thyrocytes+and+thyroid+folliculogenesis:+a+perspective+for+thyroid+tissue+regeneration+and+engineering.">Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering.</a> Endocr. J. 48, 407-425 (2001).</li><li>Toda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+models+for+studying+thyroid+biology+and+disorders.">Culture models for studying thyroid biology and disorders.</a> ISRN Endocrinol. , (2011).</li><li>Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+factors+regulating+growth+and+function+of+human+thyroid+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo.</a> 213, 47-58 (2003).</li><li>Antonica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+thyroid+from+embryonic+stem+cells.">Generation of functional thyroid from embryonic stem cells.</a> Nature. 491, 66-71 (2012).</li><li>van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh-dependent+differentiation+of+intestinal+tissue+from+embryonic+pancreas+by+activin+A.">Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A.</a> J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).</li><li>Hick, A. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9. , (2009).</li><li>Pierreux, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial:Endothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas.">Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex-vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis+in+vitro.">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro.</a> Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Papier beschreibt ein Verfahren zum Präparieren und Kultivieren der Schilddrüse Explantate (E12.5) oder Lappen (E14.5), um zu studieren und ein besseres Verständnis der komplexen Ereignisse, die zur Bildung der Schilddrüse. Aufgrund der dualen Ursprungs der Schilddrüse Anlagen (die Mittellinie Anlage und die beiden seitlichen Körper ultimobranchialen) und ihrer geringen Größe, ein Fragment von E12.5 Gewebe lokalisiert rostral Schlundbogenarterien und die das Luft-, aber nicht die Speiseröhre mikrodissekt...

Die Schilddrüse ist eine Sammlung von unabhängigen epithelialen Kugeln, genannt Follikel, von einem dichten Netz von endothelialen Kapillaren umgeben. Diese Organisation ermöglicht die Funktion der Schilddrüse: endothelialen Kapillaren bieten Thyrozyten mit Jod, für T3-und T4-Hormon-Synthese benötigt und verteilen die letzteren auf den gesamten Körper. Zwischen den Follikeln und Kapillaren verstreut, C-Zellen produzieren das Hormon Calcitonin hypocalcämische ein. Obwohl Erwachsenen Schilddrüsen Architektur und Funktionen bekannt sind, sind die zellulären und molekularen Mechanismen der Schilddrüsen embryonalen Entwicklung (Follikel Bildung und Differenzierung) beteiligt lange nicht verstanden. Während der Embryogenese Thyrozyten Vorläufer stammt als Verdickungs (die Mittellinie anlage) der ventralen Wand des Vorderdarmes Entoderm an embryonalen Tag (e) 8,5 im Maus-Embryo, während die C-Zellen Vorläuferzellen entstehen an E11.5 als tropfenförmigen Vorsprünge ( die ultimobranchialen bostirbt) der vierten Schlundtasche 2-6. Die Mittellinie Knospe steht dann aus dem Endoderm, dehnt bilateral an E13.5 den ultimobranchialen Körper auf jeder Seite der Luftröhre zu verschmelzen. Schließlich Thyrozyten in Follikel organisieren und C-Zellen zu differenzieren. Aktuelle Erkenntnisse über die Bildung der Schilddrüse kommt hauptsächlich aus histologische Analyse von festen Geweben, aber die morphogenetischen Ereignisse in der Schilddrüse Bildung beteiligt sind sehr dynamisch und beinhalten Kommunikation und Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen und mit der extrazellulären Matrix. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass thyrocyte Vorläuferzellen produzieren hohe VEGF an Endothelzellen auf die Entwicklung der Schilddrüse zu rekrutieren, und wiederum rekrutiert Endothelzellen zu fördern Follikel Bildung und C-Zellen Differenzierung 7. Die meisten Ex-vivo-Studien an der Schilddrüse haben auf isolierte Erwachsenen Schilddrüsen-abgeleiteten Zellen entweder auf 2D-Gewebekultur-Plastik d durchgeführt wurde, gewachsenPfarreien oder in 3D-Matrizen. Mit dieser Art von Kulturen, differenzierten follikulären Zellen entweder bleiben polarisiert und als Follikel organisiert oder Wiedererlangung einer 3D-Organisation 8-10. Allerdings sind diese reinen Epithelzellen, aus ihrer physiologischen Umgebung explantiert und in 2D kultiviert, ignorieren Interaktionen mit der extrazellulären Matrix, Zytokine, Wachstumsfaktoren und anderen Zelltypen, wie die Endothel-oder Nerven-Zellen, die sie normalerweise in vivo auftreten. Eine sehr schöne Studie kürzlich eine Differenzierungsprotokoll von ES-Zellen in der Schilddrüse Follikel mit einem abschließenden Kulturschritt in 3D Matrigel 11. Allerdings sind diese 3D-Kulturen fehlen Kontakt mit anderen Zelltypen. Basierend auf früheren Fachwissen auf Pankreas-und Speicheldrüsen-Organkultur 12-14, ein Verfahren zum Präparieren von embryonalen Maus Schilddrüsen anlagen und Kultivierung der Explantate auf semiporösen Filtern oder Kunststoff-Objektträger für die Mikroskopie entwickelt. WannArbeiten mit E12.5 Embryonen, die doppelte Herkunft der Schilddrüse anlagen (die Mittellinie anlage und die beiden seitlichen ultimobranchialen Körper) verhängten die Mikrodissektion eines großen Fragments von Gewebe. Dieser enthielt die Luftröhre, aber nicht die Speiseröhre und der Pharyngealbogen Arterien bis zum arytenoid Schwellung verlängert. Wenn auf Filtern kultiviert, erstreckt sich die Mittellinie Anlage seitlich an jeder Seite der Luftröhre, wo sie verschmelzen mit den ultimobranchialen Einrichtungen, um die beiden Schilddrüsenlappen, noch durch einen schmalen Isthmus verbunden sind, bilden. In der Kultur-, Epithel-Zellen vermehren, organisieren in Follikel und differenzieren sich in Thyrozyten und C-Zellen, je nach Herkunft. Endothelzellen in der mikrodissezierten Gewebe enthielt auch vermehren und dringen in die Schilddrüsenlappen, um schließlich in eine enge Verbindung mit der epithelialen follikulären Struktur, unabhängig von den Blutfluss oder zirkulierende Faktoren. Da die Entwicklung der Explantate treu rekapituliert in vivo entwickelnment, ist dieses Kultursystem optimal und Differenzierung morphogenetischen Ereignisse während der Entwicklung der Schilddrüse auftreten studieren. Schilddrüsengewebe von Wildtyp-Knockout-oder Fluoreszenz transgenen Embryonen gewonnen werden, und die Kultursystem zugänglich ist Verlust-und Gain-of-function-Experimente. Schließlich könnte Zeitraffer-Imaging von fluoreszenzmarkierten Schilddrüsen Explantate auf Mikroskopie Plastikschalen genutzt werden, um besser zu untersuchen, die Kinetik und die Kontinuität der morphogenetischen Bewegungen, die in vivo auftreten. Zeitraffer-Bildgebung hat bereits zur Verzweigung Morphogenese der Bauchspeicheldrüse oder 15,16 Ureterknospe 17 studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">&#181;-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile</td>
			<td style="width:85px;">proxylab</td>
			<td style="width:119px;">80826</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td># 33010-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">M199</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">HBSS</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:85px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:119px;">LS237450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture plate insert (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610182</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Ezrin</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MS-661-P1</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">PECAM</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">550274</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Hoechst</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo culture system to study thyroid development

Die Schilddrüse ist eine endokrine Drüse bilobated an der Basis des Halses lokalisiert ist, die Herstellung der Schilddrüsenhormone T3, T4 und Calcitonin. T3 und T4 werden durch differenzierte Thyreozyten, in geschlossenen Bereichen genannt Follikel organisiert produziert, während Calcitonin wird von C-Zellen, zwischen den Follikel und ein dichtes Netz von Blutkapillaren durchsetzt synthetisiert. Obwohl erwachsenen Schilddrüsen Architektur und Funktionen sind ausführlich beschrieben und untersucht, ist die Bildung der &quot;Angio-follikuläre&quot;-Einheiten, die Verteilung der C-Zellen im Parenchym und den parakrinen Kommunikationen zwischen Epithel-und Endothelzellen bei weitem noch nicht verstanden. Diese Methode beschreibt die aufeinanderfolgenden Schritte embryonalen Maus-anlagen Schilddrüsen Dissektion und seine Kultur auf semiporöse Filter oder Mikroskopie Kunststoff-Objektträger. Innerhalb einer Frist von vier Tagen treu rekapituliert diese Kultursystem in vivo Schilddrüsenentwicklung. In der Tat, (i) Mrd.obation der Orgel auftritt (E12.5 Explantate), (ii) Thyrozyten Vorstufen in Follikel zu organisieren und zu polarisieren, (iii) Thyrozyten und C-Zellen differenzieren, und (iv) in der mikrodissezierten Gewebe vermehren vorhanden Endothelzellen, wandern in die Schilddrüsenlappen, und eine enge Verbindung mit den Epithelzellen, wie sie in vivo zu tun. Schilddrüsengewebe von Wildtyp-Knockout-oder Fluoreszenz transgenen Embryonen gewonnen werden. Außerdem Explantate Kultur durch Zugabe von Inhibitoren manipuliert werden blockierende Antikörper, Wachstumsfaktoren oder Zellen oder konditioniertes Medium. Ex-vivo-Entwicklung in Echtzeit analysiert werden, oder zu jeder Zeit des Kultur durch Immunfärbung und RT-qPCR. Abschließend Schilddrüsen Explantatkultur kombiniert mit nachgeschalteter Vollmontage oder auf Abschnitte Imaging-und Genexpressionsprofilen bietet ein leistungsfähiges System für die Manipulation und das Studium morphogenetischen Ereignisse und Differenzierung von Schilddrüsen organogenesis.

Schilddrüsen anlages (Mittellinie und UB zusammen mit umgebenden Geweben) und Schilddrüsenlappen von E12.5 Maus-Embryonen und e13.5/e14.5, bzw. (1) präpariert. Nach einem Tag in Kultur auf Filter ist die Mittellinie Anlage sichtbar ist (Fig. 2A) als Spann auf der Oberseite der Luftröhre längliche Gewebe. Es bildet progressiv zwei Nocken an jeder Seite der Luftröhre. Wenn isoliert Schilddrüsenlappen (E13.5 oder E14.5) kultiviert werden, werden sie zu erweitern, unterziehen Morphog...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Kultur-System, um Schilddrüsenentwicklungsstudie

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

an-ex-vivo-culture-system-to-study-thyroid-development

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Unit 1

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

11.4K Aufrufe.  Université catholique de Louvain & de Duve Institute. This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Serie: An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Closed System Cell Culture Protocol Mit HyperStack Schiffe mit gasdurchlässigen Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...