The work was supported by grants from the Universit&#233; catholique de Louvain (Action de recherch&#233; concert&#233;es) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from T&#233;l&#233;vie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation &#224; la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).

マウスは大学動物福祉委員会の実験動物ケアの原則に従って上昇し、処理した。すべての手順およびプロトコルは、この委員会によって承認された。 1。顕微鏡プラスティックカルチャーチェンバースのコーティング注：層流フード内で無菌条件下で、以下のすべての手順を実行します。コー​​ティングの2種類が、機能的に同等です。 <ol><li>甲状腺組織の単離の前に一日フィブロネクチンで被覆プラスチック培養チャンバ。 <ol><li> 100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、0.25μg/ mlのファンギゾンおよび2mMグルタミン12を補充したM199培地中で50μg/ mlの最終濃度に無菌フィブロネクチンを希釈します。 </li><li>希釈したフィブロネクチン200μlの井戸をカバーし、4℃の冷蔵庫に一晩インキュベートする。 </li><li>解剖の日に、M1で一回井戸をすすぎ、フィブロネクチンを吸引99および抗生物質、グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を補充したM199200μlを最小ボリュームを追加する。 </li><li>外植片をめっきする準備ができるまでインキュベーターでコーティングされたチャンバーを残す。 </li></ol></li><li>タイプで被覆プラスチック培養チャンバーIは、甲状腺組織の単離の前に2時間コラーゲン。 <ol><li>私は10 mMのHCl中50μg/ mlの最終濃度になるようにコラーゲンの滅菌タイプを希釈します。注：氷の上にコラーゲン原液を保管してください。 </li><li> Iコラーゲン希釈タイプ200μlでウエルを覆い、室温（RT）で2時間インキュベートする。 </li><li>私は解決策を型コラーゲンを吸引、M199で一回井戸を洗浄し、抗生物質、グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を添加したM199の200μLの最小ボリュームを追加。 </li><li>外植片をめっきする準備ができるまでインキュベーターでコーティングされたチャンバーを残す。 </li></ol></li></ol>甲状腺原基含有組織（E12.5）または甲状腺ローブの2。解剖（E13.5-E14.5） 注：クリーンな解剖ツールとペトリ/培養プレートを使用してください。以下に示す一般的な手順と切開はE12.5およびE14.5胚でも同じです。 <ol><li>希望の胚（E12.5からE14.5まで）（e）の日に時限妊娠雌マウスを犠牲にし、解剖器具を用いて子宮を取り除く。 </li><li> HBSSを含む10cmプレートで解剖子宮を置きます。 </li><li>鉗子で子宮の1四肢を保持し、徐々にすべての胚を解放するために小さなハサミで子宮を開きます。 </li><li>はさみで胎盤から胚を分離し、HBSSを含む新しい10cmプレートに自分の胚体外膜で胚を移す。 </li><li>卵黄嚢と羊膜を削除します。注：この時点から、下から透視して実体顕微鏡下で動作します。解剖の手順で倍率を上げる。ツールを解剖などのガラスキャピラリーにタングステン針を使用してください。 </li><li>のような針を使用ナイフとフォーク、上顎と耳（に沿って切断し、図1（a））を含むヘッドの上部を、削除してください。 </li><li>その背中に胚を保持し、ただ、前四肢の下で、心臓（ 図1B）の上に、胚の下部そして、第神経管（Bに沿って切断し、図1（a））の余分な部分を削除します。 </li><li> HBSSを含む新しい10cmプレート内の舌（組織を配向する）と首領域を含む胚スライスを転送します。 </li><li>神経管を取り外し、組織は食道/気管（に沿って切断図1C）に後方。 </li><li>穏やか部の（bおよびb &#39;に沿って切断した図1C）、舌の両側に沿った組織切片。 </li><li>舌の延長を、食道と気管を見つけて、（ 図1D、に沿って切断）、およびボット上の組織膨潤披裂を残して、舌を離れて解剖食道/気管の（bおよびb &#39;に沿って切断した図1D）の時間両側。 </li><li>食道を削除し、その腹側を上にして気管を配置。 </li><li>このような胸腺（ 図1E）と咽頭弓動脈の側方に配置された全ての組織のような望ましくない組織を離れて解剖。 （ 図1F、赤い点線）E13.5またはE14.5胚では、気管の両側にある甲状腺ローブを視覚化し、さらに気管から葉を解剖。 </li><li>抗生物質、グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を補充した予め温めたM199培地を含有する35mm培養プレートに単離されたE12.5気管領域、又はE13.5-E14.5甲状腺ローブを転送する。 P-200マイクロピペットで予め湿らせフィルターチップを使用して外植片を転送します。 E12.5外植片の場合は、開口部を広げるために、先端の先端をカット。注：日常的に胚が同じ遺伝子型を持っている場合、すべての胚にステップ6と7を実行し、N 9月1​​1日、最終的に12＆13。 </li></ol>甲状腺外植片の3。メッキと文化<ol><li>予め温めておいた1mlの培地を含む24ウェルプレートの3ウェルに逐次転送することによって外植片を洗浄（= M199抗生物質、グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を補充した）。 </li><li>コー​​ティングされた顕微鏡プラスチック培養室に甲状腺ローブのメッキ。 <ol><li>コー​​ティングされたチャンバーから吸引物M199培地。 </li><li>慎重に、マイクロピペット、フィルタチップを用いて培養室に甲状腺外植片を移す。各チャンバーの中央に1外植片を置く。 </li><li>外植片をマトリックスに付着させるために2時間、過剰の培地を除去し、組織培養インキュベーター中で培養チャンバーを配置する（5％CO 2、37℃）。 </li><li>静かに各ウェルに予め温め培地の200から300μlを加える。 </li><li>組織培養インキュベーター中で長期培養インキュベートする。 </li></ol></li><li>メッキO半多孔フィルター上のF気管領域または甲状腺ローブ： <ol><li>予め温めた培地を330μlのに必要な24ウェルプレートのウェルの数を埋める。 </li><li>プレースフィルタ（ 例えば 0.4μmのミリポアフィルター）培地上に培養フィルター下の気泡の捕捉を避けるために注意しながら。 </li><li>慎重に、フィルタ（最大4/filter）の中心に、媒体の最小容量と甲状腺外植片を転送し、マイクロピペット、フィルターチップを使用して。 </li><li>タングステン針で外植片からの媒体と空間の過剰を取り除く。 </li><li>組織培養インキュベーター中で長期培養インキュベートする。 NOTE：層流フードの下で変更培養培地を一日おき。 7日までの文化の外植片。 </li></ol></li></ol>甲状腺外植片のため4。ホールマウント免疫染色プロトコールタングステン針を使用した（下記のステップ2の後に）フィルター上に成長させた外植片を取り除くか、細かい鉗子とプライマリ（ステップ5）、二次（ステップ7）抗体のインキュベーション（96ウェルプレート）を除くすべてのステップのための24ウェルプレートでの転送。顕微鏡プラスチック室で培養された接着性の外植片の場合は、培養チャンバー内のすべてのステップを実行します。 <ol><li>吸引除去M199培地と20分（24ウェルディッシュ中の500μLおよび顕微鏡のスライドで300μL）のための氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）で外植片を固定する。 </li><li> RTで、トリトン有するトリス緩衝生理食塩水（50mMトリス塩酸pH7.5で、150mMのNaCl、0.1％トリトンX-100 TBST）で2×10分間洗浄。 </li><li> -20℃で、すぐに外植片またはストアを処理NOTE：-20℃での長期保存のために、徐々に100％メタノールに到達するためにTBST中のメタノール濃度を増加させることによって、メタノール中に外植片を脱水する。場合には免疫染色（ステップ4）に進むことができ、徐々にメタノールにTBSTを追加することにより、外植片を再水和。 </li><li>ブロッキング溶液（10％TBST中の正常ヤギ血清でTBSTを交換してください）し、室温で30〜60分間、海シーソーロッカーにインキュベートする。 </li><li> （条件ごとに100〜200μl）をブロッキング溶液中で一次抗体を希釈します。 96ウェルプレートに24ウェルプレートから「フィルタ」植片を移す。 4℃で一晩海鋸ロッカー上の一次抗体を用いた外植片をインキュベート</li><li>次の日、バック24ウェルプレート内の「フィルタ」植片を転送する、一次抗体溶液を捨て、そして室温で45〜60分間ずつ海鋸ロッカー上TBSTで少なくとも5回洗浄する。 </li><li>正常ヤギ血清を1％含有TBST中二次抗体（1:2,000希釈で例えばヤギ抗X-アレクサフルーア）を希釈し、4℃で、暗所で海鋸ロッカー上で一晩この希釈した外植片をインキュベートする。核対比のために、一緒に二次抗体溶液とビス - ベンズイミド（ヘキスト）の1μg/ mlのがあります。 </li><li>次の日、二次抗体溶液を廃棄し、海のこぎりでTBSTで5回を洗う室温で45〜60分ごとに、ロッカー。洗浄の時には、暗闇の中で外植片を保持します。 </li><li>そっと暗闇の中で4℃で一晩渦巻くTBSTで追加の洗浄を行う。 </li><li> Postfixの10分間4℃で4％PFA中で免疫染色した外植片。 </li><li> TBSTで2回、10分間洗浄します。 </li><li> -20℃で長期保存のためのどちらか、徐々にメタノール100％を外植片を転送するか、すぐに分析します。フィルター上で培養した外植片のため、前多光子や共焦点顕微鏡を用いた分析にTBSTまたはより良い蛍光マウンティング培地で24ウェルプレート、顕微鏡室（ 例えば LabTekまたはIbidi）での転送で免疫染色した。 </li></ol>甲状腺からのRNAの5。抽出 RNaseフリーの環境で動作します。したがって、核酸およびヌクレアーゼフリーのピペットチップを使用し、汚染物質とのRNaseのベンチと機器の両方を清掃してください。フェノール/クロロホルムを基準にしているこのプロトコルは、最初のステップを実行化学フードの下の（1〜7）。 <ol><li> 1.5mlチューブ用の使い捨て乳棒を用いてRNA抽出液300μlで1甲状腺外植片または2甲状腺ローブを均質化する。サンプル間、エタノール、その後、水、その後、2％SDS中で乳棒を洗う。 </li><li> RNA抽出液の別の100μlの、ボルテックス10秒を追加し、室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 30秒間ボルテックスし、各サンプルにtRNAの20 ngのを追加します。 </li><li> 1分間ボルテックスし、クロロホルムの80μlを加える。 </li><li> 30秒間激しくボルテックスし、室温で15分間インキュベートする。 </li><li>冷蔵（4℃）遠心機で19,000×gで15分間遠心する。 </li><li>共沈剤としてグリコーゲン20μgのを含む新しいチューブに慎重に無色の上の水相を転送します。 </li><li>ボルテックスし、100％イソプロパノールアルコールを200μlを加える。 </li><li> 15〜30秒激しくボルテックスし、2〜3時間、-20℃で、または1時間-80℃でのRNA沈殿物をしてみましょう。 </li><li> 19000で30分間のスピン4℃でXG、上清を取り除く。 </li><li>ペレットを取り除くために、冷たい75％エタノールと渦の450μlでペレットを洗浄。 </li><li> 4℃、19,000×gで10分間スピンし、上清を除去する。 </li><li> 5分間のフードの下でペレットを乾燥させます。 </li><li> RNaseフリー水10μlでペレットを再懸濁し、室温で10分間インキュベートする。 </li><li>アッセイRNA濃度は、-80°Cで保存または逆遺伝子発現分析のために転記する。 </li></ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex-vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis+in+vitro.">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro.</a> Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

本論文では、解剖や甲状腺形成につながる複雑な事象を研究し、よりよく理解するために、甲状腺の外植片（E12.5）または葉（E14.5）を培養するための方法を説明します。原因甲状腺原基（正中原基および2横鰓後体）の二重の起源、そしてその小さなサイズ、咽頭弓動脈に吻側にローカライズされたE12.5組織の断片、および気管を含む、ではなく食道へ顕微解剖されています。図示のように、...

甲状腺は、内皮毛細血管の密なネットワークに囲まれた毛包と呼ばれる独立した上皮の球を集め、、です。この組織は、甲状腺機能ができます：内皮毛細血管はT3とT4ホル​​モン合成に必要なヨウ素と甲状腺細胞を、提供し、全身に後者を配布します。卵胞と毛細血管の間に散在し、C細胞は、低カルシウム血症ホルモンカルシトニン1を生産する。成人甲状腺アーキテクチャと機能はよく知られているが、甲状腺胚発生（卵胞形成および分化）に関与する細胞および分子メカニズムははるかに理解されるからである。 胚発生の間に、（C細胞の前駆細胞が滴状突起としてE11.5で発信しながら、先祖は、胎生（E）は、マウス胚における8.5で腸内胚葉の腹側の壁の肥厚（正中原基）として開始甲状腺細胞鰓BO第咽頭袋2-6のダイ）。正中芽はその後、内胚葉から切り離し気管の両側の鰓後体にE13.5で融合する二国間拡張されます。最後に、甲状腺細胞は、毛包に整理して、C-細胞が分化する。 甲状腺形成に関する現在の知識は、主に固定組織の組織学的分析から来ているが、甲状腺形成に関与する形態形成のイベントは非常に動的であり、異なる細胞種間および細胞外マトリックスとの通信との相互作用を伴う。最近の研究は甲状腺細胞の前駆細胞を開発し、甲状腺への内皮細胞を補充するための高レベルのVEGFを生産し、今度は、内皮細胞は毛包の形成を促進し、C細胞分化7募集していることを示した。 甲状腺に最もex vivoでの研究では、どちらかの2D組織培養プラスチックdに成長し、孤立した成人の甲状腺由来の細胞で行われてきたishesまたは3Dマトリックス中。文化のこれらのタイプの分化した細胞濾胞偏光したままと卵胞として組織化や3D組織8月10日の再取得のいずれかを使用して。しかしながら、それらの生理学的環境から外植し、2Dで培養されたこれらの純粋な上皮細胞は、細胞外基質、サイトカイン、成長因子、それらがインビボで通常遭遇するような内皮細胞または神経細胞などの他の細胞型との相互作用を無視する。非常に素晴らしい研究は、最近、3Dマトリゲル11における最終培養工程を用いて、甲状腺濾胞内にES細胞の分化プロトコルを記載した。しかしながら、これらの3D培養物は、他の細胞型との接触を欠いている。 膵臓および唾液に、前の専門知識に基づいて器官培養12-14腺、マウス胚性甲状腺原基を解剖し、半多孔フィルターまたは顕微鏡プラスチックスライド上植片を培養する方法が開発されました。 時E12.5胚での作業、甲状腺原基（正中原基および2横鰓後体）の二重の起源は、組織の大きなフラグメントのマイクロダイセクションを課した。これは気管ではなく食道を含有し、披裂腫れまでの咽頭弓の動脈から延長した。フィルター上に培養した場合、正中原基は、それらがまだ狭い狭部によって接続された2つの甲状腺ローブを形成し、鰓体と融合気管の各側に横方向に延びている。 文化では、上皮細胞が増殖し、毛包に整理し、その起源に応じて、甲状腺細胞およびC細胞に分化する。マイクロダイセクション組織に含まれる内皮細胞は、増殖し、最終的には独立して血液の流れや循環要因の上皮濾胞構造と密接に関連付けるために、甲状腺葉に侵入。外植片の開発は、忠実に開発し、生体内で再現するようにMENTは、この培養系は、甲状腺の開発中に発生する形態形成と分化事象を研究することが最適である。 甲状腺組織は、野生型、または蛍光ノックアウトトランスジェニック胚から得ることができ、培養系は、損失および機能獲得実験に適している。最終的には、顕微鏡のプラスチック皿上で蛍光標識した甲状腺外植片のタイムラプスイメージングは、より良い生体内で起こる反応速度と形態形成の動きの連続性を調査するために悪用される可能性があります。タイムラプスイメージングは既に膵臓15,16または尿管芽17の分岐形態形成を研究するために使用されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">&#181;-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile</td>
			<td style="width:85px;">proxylab</td>
			<td style="width:119px;">80826</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td># 33010-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">M199</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">HBSS</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:85px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:119px;">LS237450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture plate insert (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610182</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Ezrin</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MS-661-P1</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">PECAM</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">550274</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Hoechst</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo culture system to study thyroid development

甲状腺は、甲状腺ホルモンT3、T4、およびカルシトニンの生産、首の付け根に局在bilobated内分泌腺である。カルシトニンは、卵胞及び毛細血管の密なネットワークとの間に散在C-細胞により合成されている間T3及びT4は、毛包と呼ばれる閉じた球に編成分化甲状腺細胞によって産生される。成人甲状腺アーキテクチャおよび機能は、広範に記載され、研究されてきたが、「アンギオ濾胞」単位、実質におけるC-細胞の分布および上皮および内皮細胞間のパラクリン通信の形成ははるかに理解されるからである。 この方法は、半多孔フィルターまたは顕微鏡プラスチックスライド上のマウス胚性甲状腺原基の解剖とその文化の連続的なステップを説明します。 4日間の期間内に、この培養系は、忠実にインビボ甲状腺開発に再現する。確かに、（I）億臓器のobation（II）の前駆体は卵胞に整理し、分極、（III）甲状腺細胞およびC細胞が分化甲状腺細胞、及び（iv）顕微解剖した組織が増殖に存在する内皮細胞が、中に移動し、（E12.5外植片の場合）が発生密接に甲状腺ローブ、彼らは生体内でそうであるように、上皮細胞に関連付ける。 甲状腺組織は、野生型、または蛍光ノックアウトトランスジェニック胚から得ることができる。さらに、培養物は、抗体、成長因子、または細胞または馴化培地を遮断、阻害剤を添加することによって操作することができる植片。 エクスビボ開発は、リアルタイムで、または培養の任意の時点で免疫染色およびRT-qPCRにより分析することができる。 結論として、下流のホールマウントでまたはセクションイメージングと遺伝子発現プロファイリングに合わせて甲状腺移植片培養は甲状腺Oの形態形成と分化のイベントを操作し、研究するための強力なシステムを提供していますrganogenesis。

甲状腺anlages（一緒に周囲の組織との正中線とUB）、および甲状腺葉（ 図1）は、それぞれ、E12.5およびe13.5/e14.5でマウス胚から解剖されています。フィルター上の文化の中で1日を過ごした後、正中原基は、気管の上に及ぶ細長い組織として（ 図2A）に表示されます。それは徐々に気管の各側に2つのローブを形成する。単離された甲状腺ローブ（E13.5又はE14.5）が培養さ...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

アン<em&gt;生体外</em甲状腺の開発を研究する&gt;文化システム

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

11.4K ビュー.  Université catholique de Louvain & de Duve Institute. This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

ビデオ: An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

アン EX - OVO</emイメージングとマイクロサーアプリケーションに適して>ニワトリ胚培養システム

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

ガス透過性材料技術とHYPERStackの船舶を使用するクローズドシステムの細胞培養のプロトコル

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

初代ヒト卵管上皮細胞のex vivoでの文化

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

マウス胎児腸全体培養システム<em&gt;生体外</em&gt;シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

酸性細胞外 pH 培養系の確立

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...