שיטה זו משמשת לחקר קולטני חרוט אשר חיוניים לראיית אור יום. היתרון של השיטות הוא שהיא משתמשת בביצי עוף מופרות, שהן נגישות בקלות, ואחד המקורות היחידים של תרבויות חרוט ראשוניות. הפרוטוקול שימש לזיהוי גורם הכדאיות של חרוט נגזר רוד, טיפול מבטיח בעתיד לניוון רשתית בירושה.
יתר על כן, הפרוטוקול שימש לחקר חילוף החומרים פוטורצפטור חרוט. על ידי ביצוע זהיר של הפרוטוקול המתואר, אדם שמומחיותו היא בתרבות התאים העיקרית, צריך להיות מסוגל להשיג תרבות מועשרת חרוט לאחר ניסיונות ספורים בלבד. התחל על ידי איסוף ביצים מופרות שבועיות מדגרה תעשייתית.
לשמור על הביציות המופריות ב 17 מעלות צלזיוס במעבדה. עבור כל תרבות, דגירה שבע ביצים מופרות במשך 24 שעות ב 20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 136 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח עם היפוך לסירוגין של נטייה. כדי לשחזר את עוברי העוף, לשטוף את פני הביצים עם חיטוי, לשבור את קליפת הביצה על ידי ביצוע חור בחלק העליון של הקליפה עם צבת ישרה גדולה, ולאחר מכן לחתוך את הקליפה כדי להסיר את הכובע מן הביצה.
מוציאים בעדינות כל עובר מקליפת הביצה עם מלקחיים מעוגלים ומעבירים אותו לצלחת פטרי המכילה PBS סטרילי שחומם בעבר ל-37 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את המעטפה המקיפה את העוברים. לאמת את שלב ההתפתחות של כל עובר על ידי השוואה חזותית להמבורגר והמילטון ולבחור שני עוברים בשלב ה -29 של הפיתוח להאנקת העיניים של עוברים נבחרים אלה ולהעביר אותם למדיום פחמן דו חמצני עצמאי.
עבודה במדיום פחמן דו חמצני עצמאי, למקם ארבע עיניים עם הקרנית פונה כלפי מטה ואת עצב הראייה מול הניסוי. לקדוח חור בעצב הראייה באמצעות שתי מלקחיים ישרים. הכנס ענף של כל מלקחיים בין הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט, ולאחר מכן למשוך ולסובב את העין כדי לנתק את האפיתל מן הרשתית.
הסר את הקרנית, ואחריו את העדשה ואת זגוגית. מעבירים את ארבע הרשתית לצלחת פטרי המכילה את המדיום של רינגר ב-pH 7.2. חותכים את ארבע הרשתיות לחתיכות קטנות מאוד באמצעות שני צבת ישר לשטוף את החלקים פעמיים עם המדיום של רינגר.
לאחר הכביסה השנייה, תן את חתיכות הרשתית ליפול לתחתית הצינור ולהסיר את התקשורת. לטפל חתיכות הרשתית עם פתרון של טריפסין במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות, לעצור את התגובה על ידי הוספת מדיה תרבות בתוספת 10% מומת סרום עגל העובר.
דגירה ההשעיה התא עם 0.05 מ ג של DNase 1 ואז מיד לנתק את אשכולות התא ואת ה- DNA על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה. לשטוף את ההשעיה תא הרשתית פעמיים עם מדיום תרבות מוגדר כימית או CDM. פנקו שתי צלחות תרבות שחורות של 96 בארות עם תחתית שקופה עם פוליצין במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
בסיום, יש לשטוף את הצלחות פעמיים במדיום התרבות M199. הוסף כחול Trypan aliquot של 10 microliters של המתלה התא כדי להכתים את התאים החיים. לאחר מכן הוסף את דגימת השעיית התא למד המוציטרומטר.
לאחר ספירת התאים, להביא את ההשעיה התא לריכוזים המתאימים באמצעות CDM. הוסף 50 מיקרוליטרים של ספריית המולקולות שיוקרנו באמצעות תבנית מוגדרת מראש. זרעו את 50 המיקרוליטרים של שתי השעיות התאים לשתי צלחות התרבות השחורות המטופלות מראש של 96 בארות.
פזרו את התאים בלוחות בעזרת פיפטה רב-ערוצית מימין ללוח שמאלה, והומוגניזציה בין כל עמודה. ואז להדגיר את הצלחות במשך שבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, תחת 5% פחמן דו חמצני ללא שינוי של מדיה. כדי לספור את התאים קיימא, להוסיף 2.7 קלצ'ין micromolar AM ו 0.3 מילימולאר אתידיום homodimer לכל באר של הצלחת.
דגירה הצלחות במשך שעה בטמפרטורת החדר בהיעדר אור. קרא את הפלואורסצנטיות על קורא לוחות אוטומטי המורכב ממיקרוסקופ הפוך המצויד במנורת כספית עם שני מסנני עירור ב 485 ו 520 ננומטר, שני מסנני פליטה ב 520 ו 635 ננומטר ומצלמת מכשיר מצמד טעינה. פרוטוקול זה שימש כדי להקרין ספריית cDNA מנורמל עשוי אפיתל choroid ו הרשתית פיגמנט מ 400 עיניים של שמונה שבועות, חולדות לונג-אוונס.
בסך הכל 2, 112 סטים של 100 שיבוטים המתאימים 211, 200 שיבוטים בודדים הוערכו. בין 42 בריכות של שיבוטים עם יחס גדול משניים, בריכות 0080 ו 0073 היה יחס הכדאיות 16 ו 14 פעמים גבוה יותר מאשר שליטה שלילית לאחר שבעה ימים של תרבות. כל אחד מ-100 השיבוטים נבחר ל-16 סטים של 10 שיבוטים ממלאי הגליצרול שלהם.
מאגר המשנה 0073-09 נתן את יחס הכדאיות החזק ביותר והיה מחולק לייצר 16 שיבוטים בודדים שנבדקו בסיבוב שלישי של הקרנה על תרבויות מועשרות חרוט. השיבוט 0073-09-37 בלט עם יחס כדאיות של 2.5. ניתוח נוסף אישר כי שיבוט זה יש השפעה חזקה לשחזור על הישרדות חרוט.
הבדיקה חזרה על עצמה באופן עצמאי וההוספה של 1.8 קילו-בייסים הייתה ברצף. ניתוח ביואינפורמטי גילה כי שיבוט 0073-09-37, אשר נקרא אפיתל נגזר חרוט גורם הכדאיות, או EdCVF מכיל שלוש מסגרות קריאה פתוחות. כאשר נבדק באופן עצמאי, רק ORF1 הפעיל אפקט מגן על הקונוסים.
ORF1 יוצר כחלבון גלוטתיון S-טרנספראז. גורם הכדאיות של חרוט שמקורו באפיתל טוהר ותג GST הוסר. ניתוח של פעילות טרופית הראה כי EdCVF הוא מסוגל למנוע ניוון חרוט במערכת התרבות מועשרת חרוט.
בעת ניסיון הליך זה, שלב ההתפתחות של העוברים צריך להיבדק בקפידה על מנת לקבל את התרבויות מועשר חרוט. בעקבות פרוטוקול זה, התאים יכולים להיות electroporated עם DNA פלסמיד לחקור את המנגנונים המולקולריים של כל גורמי ההישרדות כגון RdCVF. טכניקה זו סוללת את המחקר המטבולי כולל פיתוח מודלים מתמטיים של הישרדות חרוט.
