Name: analysis of epididymal protein synthesis and secretion
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
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著者は、この作業をサポートするため国立保健医療研究評議会のオーストラリア プロジェクト助成金 APP1103176 を認識したいと思います。

動物組織のコレクションを含むすべての実験手順は、ニューカッスル大学の動物のケアと倫理委員会によって承認されました。
1. 蛍光染色パラフィン埋め込まれた精巣上体セクション (図 1 および 2)
<ol><li>CO2吸入 (スイス マウス、8 週間以上古い) 経由で成体の安楽死、直後に慎重に解剖 (外科はさみとピンセットを使用して) 精巣上体覆う結合組織や脂肪の無料、Bouin の定着剤に浸すソリューション (> 10 倍ボリューム/組織重量) 一晩固定用。</li>
	<li>2 日間 2 × 変更 70% エタノールをティッシュを毎日洗うし、浸潤およびパラフィン ブロックを埋め込むのための準備として傾斜エタノール (70%、95%、100%) を脱水します。</li>
	<li>4-6 μ m との免疫蛍光染色の準備のスライド マウントの厚さでパラフィン ブロックをセクションします。</li>
	<li>ヒューム フードの組織切片 (3 × 5 分たびに) を完全に没頭するスライドの瓶にキシレンの十分な量を追加することで精巣上体のパラフィン切片を dewax します。</li>
	<li>ティッシュ セクションを精製 H2O で希釈した傾斜のエタノール溶液に浸漬して水分補給 (100% エタノール 100% エタノール 90% エタノール エタノール 80%、70% のエタノールの 1 分 1 分 5 分 5 分 1 分、50% エタノール 1 分)。</li>
	<li>十分なリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 全体の組織切片を完全に没頭すると 5 分のために一度スライド jar ファイル内のセクションを洗う (すべての後続洗浄手順に従う)。</li>
	<li>適切な抗原検索ソリューションをデカント (すなわち。, 10 モル/L のクエン酸ナトリウム、50 ミリ モル/L トリス pH 10.5 または検出する抗原によって、代替抗原検索の解決法) スライド ラック、沸騰するまで電子レンジに。このソリューションにスライドの組織切片を対象 (表 1参照) 個々 の抗体のために最適化された熱による抗原検索条件。 注意: は、スライド、抗原検索プロセス中に抗原検索ソリューションに完全に浸すことを確認します。</li>
	<li>部屋の温度、電子レンジ、クールからスライド コンテナーを削除します。</li>
	<li>PBS でスライドをすすぎ、ティッシュ セクションまわりトレースする液体撥スライド マーカー ペンを使用します。</li>
	<li>(コンテナーの基地で湿らせたティッシュによって作成された)、加湿コンテナーにスライドを配置し、ブロック ソリューションを適用 (3 %bsa/PBS、以前フィルター 0.45 μ m のフィルターを通して) 37 ° C で 1 時間</li>
	<li>PBS で一度スライドをすすいでください。</li>
	<li>セクションをフィルター処理された 1% で実験的に最適化された濃度に希釈して適切な一次抗体とインキュベート BSA/PBS 一晩の 4 ° C で (アンチ DNM1、DNM2 と DNM3 の 1: 60 抗体; 抗 ATP6V1B1 抗体の 1: 100材料の表を参照してください抗体の詳細について)。 注: を区別する特定非特異抗体の結合からそれ含める必要は厳しい負 (すなわち。、二次抗体のみ、一次抗体ペプチドを免疫に対して preabsorbed) とポジティブ コントロール24。</li>
	<li>30 分間室温で配置することによって、スライドを rewarm します。</li>
	<li>10 分間振動プラットホーム (60 rpm) の PBS でスライド 3 × を洗ってください。</li>
	<li>セクションを 1% で希釈した適切な二次抗体とインキュベート BSA/PBS (0.45 μ m フィルターで濾過) 1 h 37 ° C で (1: 400 すべての二次抗体の希釈は、抗体については、材料の表を参照)。 注意: この手順以降から暗闇の中スライド コンテナーを保持します。デュアル ラベルは、二次抗体の互換性のある組み合わせを選択 (すなわち。、二次抗体が異なる種で提起されている必要があります)。</li>
	<li>10 分間振動プラットホーム (60 rpm) の PBS でスライド 3 × を洗ってください。</li>
	<li>Propidium ヨウ化 (PI、7.48 μmol/L) または 4΄、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、4.37 μmol/L) 細胞核をラベルするために室温で 2 分間でセクションを counterstain します。</li>
	<li>5 分間振動プラットホーム (60 rpm) のスライドを PBS で 2 回洗います。</li>
	<li>10% Mowiol 4-88 は 0.2 mol/L トリス (pH 8.5) の 30% のグリセロールの解決の準備セクションをマウントおよび 2.5 %1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-オクタン。</li>
	<li>爪ニス coverslip をシールし、将来の観測のための 4 ° C でスライドを保存します。 注意: 画像スライドのできるだけ早く実用的な蛍光の過剰な損失を避けるために準備の後を実行することをお勧めします。</li>
</ol>2 分離、マウス精巣上体頭 (図 3) から Epididymosomes の
<ol><li>CO2吸入 (スイス マウス生後 8 週間以上) 経由で成体の安楽死、直後に加温した PBS (37 ° c) 精巣組織の血液汚染を最小限に抑えることで、血管を灌流します。 注意: 血漿には epididymosomes25に同じようなサイズであるエクソソームの多様な集団が含まれています。精巣組織から血中滞留性をアクセスことができます、最初のセグメントの検査を介して高度に血管精巣上体セグメント位置頭セグメントに近位 (すなわち、ゾーン図 1Aの 1)。</li>
	<li>慎重に表面の任意の可能性を減らすために変更された結びつけること、ウィッテン、ウィッティンガムの媒体 (BWW; pH 7.4 では、300 ミリ モル/kg 水26,27の浸透圧) を覆う脂肪・結合組織、リンスの無料の精巣上体を解剖します。血液汚染。</li>
	<li>しみの余分なメディアを削除、精巣上体頭を解剖する精巣の組織 (すなわち。、ゾーン 2-5、図 1 a) と BWW 媒体を含んでいる新鮮なペトリ皿 (35 × 10 mm) に移転。培地の量が最終的な回復のために十分であることを確認します。 注: 6 頭 epididymides のお勧めは、均等に分割し (手順 2.9 参照) 2 の事前に用意されたグラデーションの上に適用される ~ 900 μ L の回復を可能に 1.1 mL の培地を使用します。</li>
	<li>かみそりの刃で頭組織に小切開の数を作る。組織をミンチし、過度のゾル性細胞質の内容とサンプルの汚染を避けるためにしません。内容をリリースする 30 分の 37 ° C で軽度の動揺と組織を含むプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>細胞の残骸を削除する 70 μ m の膜を通して得られた懸濁液をフィルター処理します。</li>
	<li>濾液を収集し、これを対象細胞残屑を除去するために速度を増加すると 4 ° C で連続遠心分離手順 (すなわち。、500 × g、2,000 × g、4,000 × g、8,000 × g、5 分ごと。17,000 × g 20 分と最後に 17,000 × gさらに 10 分間、または遠心分離後ペレットが形成されない)。 警告: 最小限の血液汚染があることを確認する最初の 500 × g遠心分離のステップ後ペレットの色を評価するために重要です。このペレットにピンクの着色が表示されます任意のサンプルを破棄します。</li>
	<li>0.25 mol/L ショ糖と 10 ミリ モル/L トリス (pH 7.5) の溶液で希釈 (60% (w/v) 水溶液 iodixanol から成る) 密度勾配媒体によって不連続 iodixanol の勾配 (層を構成する 40%、20%、10%、5%) を準備します。</li>
	<li>450 μ L (図 3) の各分画の超遠心機チューブ (11 × 35 mm)、グラデーションを準備します。精巣上体液サンプルをロードする前にそれぞれの層の間のインターフェイスが正常に形成されることを確保するため、各分画のアプリケーション後、グラデーションを目視で確認します。ただし、利用日に各グラデーションの新鮮なを準備、精巣上体管腔液サンプルを読み込み前に 2 h まで 4 ° C で保存できます。</li>
	<li>精巣上体管腔流体サスペンション (3 epididymides の頭からの材料を収集に対応する) の上に単一勾配の 450 μ L を慎重に追加します。</li>
	<li>超遠心機 4 ° C、18 h で 160,000 × gでグラデーション。 注意: この遠心分離が行われるので非常に高速で、すべての超遠心機チューブ ペア、正確にバランスの取れた。チューブの整合性を損なう可能性がある目に見える傷がないことを確認するを確認します。</li>
	<li>12 の等しい分数 (それぞれ 185 μ L から成る) を慎重に取り外します最上部層から始まって、グラデーションの下の方へ進んでいます。該当する場合、各グラデーションから回復した同等の端数 (最大 2 つのグラデーション) をプールします。 Epididymosomes 最も高い分数 9 1122で濃縮されマウスの注意:図 4との議論を参照してください。</li>
	<li>回復および 9-11 の分数のプール後 100,000 × gで 3 h の 4 ° C (13 × 56 mm チューブ) ペレット、epididymosomes へのサンプルを 2 mL の PBS の超遠心機に希釈します。 注意: epididymosome ペレットを参照してくださいすることは困難にすることができます、のでとローターに配置されます epididymosome ペレットの妊娠中の位置を示す管をマーク指摘チューブの向きを確認します。各管に十分な量が含まれていることを確認 (すなわち。、その総容量の 50% を超える) 管の崩壊のリスクを排除します。</li>
	<li>慎重に吸引、epididymosome ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。</li>
	<li>Epididymosome 純度 (図 4) を評価します。</li>
	<li>下流のアプリケーションに応じて必要な媒体に epididymosome ペレットを再懸濁します。例えば、BWW 媒体は通常精子あるいは SDS ページ経由で精巣上体のプロテオームの解像度のための準備の適切な換散バッファーと共同の孵化にかかわる実験使用されます。</li>
</ol>3. 蛍光 mECap18 細胞の染色
<ol><li>(セル文化フードで行われる) に滅菌 coverslips の準備<ol>
<li>10 分の 70% エタノールに coverslips (12 × 12 mm) を浸漬し、エタノールのランプの上の高温乾燥で消毒します。</li>
		<li>10 の coverslip のクールな s 12 ウェル プレートに転送する前に。</li>
		<li>滅菌したポリ-L-リジン溶液、coverslip をカバーし、室温で 10 分間のために解決を適用します。</li>
		<li>ポリ-L-リジン液を捨て、洗浄滅菌 H2O coverslip または適切な媒体。</li>
	</ol>
</li>
	<li>準備 mECap18 セル<ol>
<li>2 × 105 mECap18 細胞、coverslips を含む 12 ウェル プレートの各ウェルの因数を通路します。</li>
		<li>MECap18 セル中程度 (1 %l-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム 1%、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN DMEM) 含む 10% ウシ胎仔血清 (FBS 雰囲気 5% の下で 37 ° C の定温器で) の細胞を培養します。CO2一晩。</li>
		<li>セルは、coverslip に従う、培地を除去、PBS で 2 回細胞をすすいでください。</li>
		<li>全体 coverslip を浸し、15 分間室温でセルを修正する PBS で希釈した 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の十分な量を追加します。</li>
		<li>PFA 液を捨て、PBS で 2 回、coverslips をすすいでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>免疫蛍光染色<ol>
<li>0.1% 浸漬によって mECap18 セルを permeabilize トリトン X-100 10 分 PBS で。</li>
		<li>PBS で coverslips をすすいでください。</li>
		<li>3 %bsa を用いた mECap18 細胞をブロックし、精巣組織のセクションで説明したのと同じプロトコルを利用した細胞の反応を続行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. エアコン細胞培養液からのタンパク質の単離
<ol><li>調節された細胞培養培地のコレクション<ol>
<li>6 の 4 × 105 mECap18 細胞の通路因数も 10% を添加した mECap18 細胞用培地板 24 h の FBS。</li>
		<li>残留 FBS および関連を削除する (FBS を使わず) mECap18 細胞用培地と mECap18 細胞を 3 回洗浄蛋白質の汚染物。</li>
		<li>各ウェルに mECap18 細胞用培地 (FBS を使わず) 1.5 mL を追加し、37 ° C の定温器 5% 未満で 12 h の mECap18 細胞と孵化 CO2。 注: このステップで mECap18 細胞は、実験デザインによると別のターゲット抗原を評価できます。</li>
		<li>12 時間培養後細胞培地とすべての細胞の破片を削除する 10 分間 2,000 × gで遠心分離を収集します。 注: 孵化の持続期間は実験デザイン/エンドポイント評価に従ってと応用治療細胞の耐性を考慮して変更することができます。最適な結果を達成していることを確認する特定の実験的レジメンに基づいて孵化のタイミングを調整することをお勧めします。</li>
		<li>標準トリパン ブルー色素排除試験28のアプリケーションを介して mECap18 セル実行可能性を評価します。細胞生存率が減った死亡または瀕死の細胞から放出されたタンパク質によって導入されたバイアスを除去するために 90% 以下すべての材料を破棄します。</li>
		<li>細胞用培地からの蛋白質を次のように分離または-80 ° C で媒体を維持</li>
	</ol>
</li>
	<li>(発煙のフードで行われる) に蛋白質の隔離<ol>
<li>80% ボリューム調節細胞用培地培養 mECap18 細胞から放出されたタンパク質を沈殿させるに冷蔵 100% トリクロロ酢酸量の 20% を追加します。一晩で定数混合 4 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>培養後、遠心分離によって沈殿したタンパク質をペレット (17, 000 × g, 10 min. の 4 ° C)。 注意: 蛋白質中に分泌され、期待の限定数量により、ペレットがないは遠心分離後も容易に視覚化することが可能は。したがって、遠心分離前にチューブをオリエンテーションし、上澄みの削除中に妊娠中のペレットの場所を邪魔しないように世話を正しくすることが不可欠です。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、再遠心分離前に冷やしたアセトンで 2 回餌を洗浄 (17, 000 × g, 10 min. の 4 ° C)。</li>
		<li>慎重に取り外し、ヒューム フード内の任意の残留アセトンを乾燥する前に上澄みを廃棄します。</li>
		<li>完全な分泌タンパク質プロファイルおよび/または個々 のターゲット蛋白質を検出するエンドポイント分析に備えて適切な抽出バッファーで蛋白ペレットを再懸濁します (e.g。、SDS-PAGE、イムノブロット)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

これらの研究には、パラフィン包埋、セクショニングの標準プロトコルにさらされていたブアン固定精巣組織の使用が組み込まれています。ブアン固定液には、具体的かつ相補的な機能を持つ各コンポーネントにホルムアルデヒド、ピクリン酸と酢酸の混合物が装備されています。したがって、タンパク質の架橋結合を形成する第一級アミンと反応してホルムアルデヒドが、ピクリン酸はゆ?...

すべての哺乳類の種の精子を取得前方の進歩的な運動を表示して精巣上体、可能性があります男性の精巣余分なダクト システムの専門性の高い領域での長期にわたる降下中に卵子を受精する可能性7-14 日 (種) によって移動するを取る1。父系クロマチンの極端な凝縮と精巣内精子の分化に伴う細胞質の多数の放出のための後続の機能的成熟はの相互作用によってのみ駆動します。精巣微小環境。この環境は、ライニング精巣上体相馬の分泌・吸収活動によって作成され、ターンでは、セグメント バリエーション1の例外的なレベルが表示されます。したがって、タンパク質の合成と分泌の面で最もアクティブなセグメント、精巣上体 (すなわち、頭とコーパス)2の近位部にあります。このアクティビティ ミラー機能の能力の特徴を表示する最初の細胞と精子の機能のプロファイル (すなわち、進歩的な運動とするソーナの酸可溶性糖タンパク質に結合する機能) 次の。3頭精巣上体を通過。これらの機能的な属性は精子射精のための準備で静止状態で格納される前記遠位精巣上体セグメント (バーニャカウダ) に到達、最適なレベルに達する前に開発し続けます。形成とこの精子の貯蔵貯蔵所の維持は、馬尾の強い吸収活動4,5によって支配される粘膜上皮とも密接に結びついて。このような地域ごとの分業が哺乳類の種の大半の間で共有される精巣上体の特徴的な表示されます解剖学的違いは、報告された6,7、8をされていますが、私たち自身の9,10を含む日付を検討した.確かに、それ臨床的観点からは、精巣機能障害男性因子不妊11、こうしてこの専門組織の規制を理解することの重要性を強調の病因に重要な貢献を作ることが知られています。
したがって、精巣上体の生理学の私達の理解と精子の成熟とこの組織内のストレージの連続相を調節するメカニズムが完全に解決するに残っているは残念です。貢献の要因の間で精巣上体の研究の進歩に制限は、この組織の全体的な複雑さとその内腔の微小環境を規制制御メカニズムの知識です。解剖学的, 我々 は知っている、頭、コーパスと馬尾のセグメントの区別を超えて精巣上体 (図 1 a) いくつかのゾーンに細分されることができます、各隔壁12で区切られた、遺伝子/タンパク質の離散分布によって特徴付けられる式13,14,15,16,17,18。確かに、詳細な精巣上体における分節遺伝子発現の転写プロファイリング、に基づいてできるだけ多く 6 と 9 の精巣上体ゾーンはマウスおよびラットのモデルは、それぞれ19,20で報告されています。このような複雑さはおそらく精巣上体の相馬、偽重層上皮を構成する多数の異なったセルタイプ。 の組成を反映しています。管の長さに沿って豊富、配布および分泌・吸収活動に関してはそれぞれ異なります。したがって、主細胞は、これまでで、最も豊富な精巣細胞型を構成するすべての上皮細胞の 80% 以上。したがって、主細胞、精巣上体のタンパク質生合成と分泌5の大半を担当。対照的に、精巣上体の相馬内で 2 番目の最も豊富なセル型としてランク付けする、明細胞の人口主に内腔のコンポーネントの選択的吸収と5本の微小環境の酸性化に関与しています。男性ホルモンおよび精巣の起源の他の lumicrine の要因を出す管に沿って自分の位置によってこれらの精巣細胞型の差動制御の複雑さの別の層を追加するには。
このような複雑さの制限にもかかわらず重要な侵害は精巣機能のメカニズムの基礎を解決するのに行われ続けます。これらの研究のキーは、これらの初期調査の中から選択した個々 のタンパク質の詳細な分析とタンデムで精巣上体のプロテオームの幅広く在庫を確立する高度な質量分析戦略のアプリケーションをされています。このアプローチの例が、そこマウス モデル21で mechanoenzymes 族の私たちの最近の評価。そこで我々 の初期の関心は、エキソおよびエンドサイトーシス プロセスのカップリングにそのデュアル アクションによって支えられていた。そこ (DNM1 - DNM3) の 3 つの標準的なアイソ フォームがマウス精巣上体で高発現し、タンパク質の分泌と吸収21 における調節的役割を果たすために適切に配置されていることを示すことができたこれらの観察結果を踏まえ、.また、できた明確に各細胞と細胞内局在、に基づいてそこにアイソ フォームを区別するために示唆精巣上皮21内の冗長、アクティビティではなく、相補的な所有しています。
ここでは、採用希望この情報が精巣上体、代替タンパク質の特性でより広いアプリケーションを見つけるに貢献するためにマウスの精巣上体におけるそこ発現の研究のため実験方法について述べる、男性の生殖管のこの重要な要素の機能を理解します。具体的には、堅牢な蛍光ラベリング パラフィン精巣切片の標的タンパク質と蛍光抗体法によってこれらの蛋白質の分布の後続の検出手法の開発について述べる顕微鏡検査。我々 はさらに私たち最近最適化されたプロトコルの22の単離と解析 epididymosomes; を文書化します。小さなエキソソームのような小胞精巣の分泌プロファイルの重要な要素を構成する、精子成熟23を促進する上で重要な役割を保持するために表示されます。補完的なアプローチとしても述べる不死化マウス頭精巣上皮 (mECap18) の細胞ラインのターゲット蛋白質の蛍光検出および精巣上体の規制を探索するためのモデルとしてこのリソースの使用分泌活動体外。

<table><tbody><tr><td>Dynamin 1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 2 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 3 antibody</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>ATP6V1B1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: monoclonal</td></tr><tr><td>Flotillin-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>ALOX15 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>TUBB antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Mouse, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: monoclonal</td></tr><tr><td>PSMD7 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Donkey, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Donkey, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Mouse HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>4&#039;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Thermo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;alpha;-androstan-17&amp;beta;-ol-3-oneC-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Thermo</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Astral</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-gysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly (vinyl alcohol)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuges</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>Large Orbital Shaker</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>Lab pH Meter</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>Liquid-repellent slide marker</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m filter</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Dustfree Paper</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 &amp;times; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 &amp;times; 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;micro;m Nylon</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 &amp;times; 10 mm with cams</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Slide jar</td><td>TRAJAN</td><td>#23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of epididymal protein synthesis and secretion

哺乳類の精巣上体は後精巣の成熟と精子のストレージをサポートするためにすべての内分泌腺の最も複雑な管腔内流体のいずれかを生成します。このような複雑さは、粘膜上皮細胞の結合分泌・吸収活動のため発生します。ここでは、ダイナミン (そこ) mechanoenzymes; のモデル蛋白質家族に焦点を当てた精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析手法について述べる大規模な低分子量 g 蛋白質双方向膜人身売買イベントを規制する可能性があります。精巣組織の蛋白質の表現の検討, 蛍光ラベリング パラフィン埋め込まれたセクションの標的タンパク質とを介してこれらのタンパク質の分布の後続の検出のための堅牢な方法論について説明します。蛍光顕微鏡検査。分離と小胞、成熟精子細胞と細胞間のコミュニケーションに参加する精巣の内腔に分泌する epididymosomes として知られているようなエキソソームの特性の最適化手法についても述べる。補完的なアプローチとして SV40 不死化マウス頭精巣上皮 (mECap18) の細胞ラインのターゲット蛋白質の蛍光検出について述べる。さらに、精巣の分泌活性の調節を探索するために適した体外モデルとして mECap18 細胞株の有用性について論じる。この目的のため培養 mECap18 細胞株およびその分泌タンパク質プロファイルに影響を与えることができる選択的薬理学的阻害療法の使用メンテナンス要件をについて説明します。後者は、SDS-PAGE および免疫ブロット経由で彼らの後の分析、トリクロロ酢酸/アセトンの沈殿物によって分泌された蛋白質の濃度条件培の収穫を使って容易に評価。我々 は、これらの結合方法が精子成熟および/またはストレージの機能的役割の決定へのプレリュードとして代わりとなる精巣上体蛋白質ターゲットの分析に適していると主張します。

図 1と図 2は、マウスの精巣上体頭にそこの局在を蛍光抗体法の代表的な結果を示します。3 そこアイソ フォームの各表示異なるローカライズ プロファイルを検討した.したがって、DNM1 は、(図 2 a) 初期セグメントと頭の精巣上体全体で精巣の細胞の比較的控えめなびまん性ラベルが特徴?...

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Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

パラフィン埋め込まれたマウス精巣のセクションで蛋白質の検出と精巣細胞の不死化線 (mECap18) のためのプロトコルを説明するダイナミンの蛍光抗体法により局在を報告する.また精巣上体液やエアコン携帯メディアから分泌蛋白質の隔離のためのプロトコルについて述べる。

精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

analysis-of-epididymal-protein-synthesis-and-secretion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K ビュー.  University of Newcastle. パラフィン埋め込まれたマウス精巣のセクションで蛋白質の検出と精巣細胞の不死化線 (mECap18) のためのプロトコルを説明するダイナミンの蛍光抗体法により局在を報告する.また精巣上体液やエアコン携帯メディアから分泌蛋白質の隔離のためのプロトコルについて述べる。

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

生化学

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

発生生物学

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

生物学

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

医学

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析

要約

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グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

リーシュマニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリマウス肝細胞の分離

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、アフリカツメガエル

工場ポリソームプロファイリングのための簡単な方法

精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析

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雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル

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リーシュマニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリマウス肝細胞の分離

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