Uno dei meccanismi proposti con cui gli anticorpi terapeutici anti-Tau riducono la patologia nel morbo di Alzheimer è l'assorbimento nella clearance dell'ex Tau patologico aggregato da microglia. Qui presentiamo il saggio della base cellulare per valutare l'assorbimento di Tau da parte delle microglia. Questo saggio rappresenta un utile strumento investigativo per caratterizzare al meglio il meccanismo d'azione degli anticorpi anti-Tau.
Il primo giorno dell'esperimento, preparare le cellule BV-2 lavandole prima con 1x PBS nel pallone in cui sono state coltivate. Quindi incubarli con EDTA allo 05% di tripside a 37 gradi Celsius e 5%C02 fino a quando non si staccano dal pallone. Sospendere di nuovo le celle nel supporto di coltura pipettando su e giù da tre a cinque volte.
Contare le cellule e preparare una sospensione cellulare con una concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro in terreno di coltura contenente 200 microgrammi per millilitro eparina. Aggiungere 250 microlitri di questa sospensione cellulare per pozzo in una piastra inferiore piatta da coltura tissutale a 96 pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con 5%C02, durante la notte.
Dopo aver scongelato aggregati di pH dye-Tau precedentemente preparati sul ghiaccio, diluirli in 65 microlitri per condizione di mezzo privo di siero, per fare una soluzione nanomolare 500. Diluire gli anticorpi in 65 microlitri di mezzo privo di siero per ottenere il doppio della concentrazione desiderata. Mescolare gli aggregati e gli anticorpi del colorante di pH in una piastra inferiore a U da 96 po '.
Sigillare questa piastra di diluizione e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente rimuovere il mezzo dalla piastra del pozzo 96 con celle BV-2. Lavare le celle in ogni pozzo con 100 microlitri a temperatura ambiente 1x PBS.
Rimuovere pbs dalla piastra cellulare BV-2. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 125 microlitri di amino complessi dalla piastra di diluizione a ciascun pozzo di una piastra cellulare BV-2 da 96 pozzetti e incubare per due ore a 37 gradi Celsius con 5%CO2. Dopo l'incubazione rimuovere gli ammino complessi dalle cellule e lavare le cellule in ogni pozzo con 100 microlitri a temperatura ambiente 1x PBS.
Dopo aver rimosso il 1x PBS aggiungere 50 microlitri del 25% di tripside EDTA e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius con 5%CO2. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di mezzo di coltura e sospendere di nuovo il pozzo pipettando su e giù per staccare le cellule. Trasferire le cellule su una piastra inferiore a U di 96 po 'e centrifugarla a 400 x g per 5 minuti a 4 gradi Celsius.
Posizionare la piastra sul ghiaccio e rimuovere il mezzo. Aggiungere 150 microlitri di ghiaccio freddo 1x PBS E centrifugare di nuovo a 400 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Posizionare la piastra sul ghiaccio e lavarla di nuovo rimuovendo 1x PBS aggiunto in precedenza e aggiungendo 150 microlitri di PBS ghiacciato per pozzo.
Centrifugare di nuovo alle stesse condizioni. Posizionare la piastra sul ghiaccio e lavare le celle rimuovendo il PBS precedentemente aggiunto e aggiungendo 150 microlitri tampone FACS per pozzo. Centrifugare di nuovo a 400 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius.
Posizionare la piastra sul ghiaccio e rimuovere il tampone FACS precedentemente aggiunto e sospendere di nuovo le celle in 200 microlitri tampone FACS per pozzo. Procedere immediatamente all'analisi da parte della FACS per acquisire 20.000 eventi nel cancello della cella viva. Per l'analisi FACS utilizzare l'area di dispersione in avanti o l'area di dispersione FSCA rispetto a quella laterale o il grafico di densità SSCA per gate sulle cellule vive escludendo eventi con livelli di dispersione in avanti inferiori, come detriti e cellule morte.
Quindi all'interno della popolazione di cellule vive utilizzare FSCA rispetto all'altezza di dispersione diretta o FSCH per creare un gate singlet ed escludere doppietti e aggregati di celle. Quindi utilizzare gli eventi nel gate singlet per generare un istogramma a parametro singolo di tintura pH. Utilizzare l'istogramma generato per determinare prima l'intensità media della fluorescenza.
Successivamente determinare la percentuale di cellule positive di pH dye-Tau escludendo le cellule negative come determinato utilizzando l'unico controllo di BV-2. Gli anticorpi CBTau-28.1 promuovono l'assorbimento di Tau nelle cellule BV-2 in modo dipendente dalla dose, come dimostrato dalla citometria del flusso. L'anticorpo ad alta affinità doppio mutante CBTau-28.1 mediava l'assorbimento di Tau nelle cellule BV-2 in misura maggiore rispetto all'anticorpo di tipo selvatico.
I frammenti di CBTau-28.1 Fab non hanno aumentato l'assorbimento basale di Tau indicando un meccanismo di internalizzazione mediato dal recettore FC. La microscopia confocale ha confermato l'aumento mediato degli anticorpi dell'assorbimento di Tau. La tintura di pH verde etichettata Tau si aggrega spesso co-localizzata con organelli acidi macchiati di colorante rosso lisotracker suggerendo così la presenza di aggregati Tau in un compartimento endolisosomiale.
I frammenti di CBTau-28.1 Fab non aumentavano di nuovo l'assorbimento di Tau indicando che l'assorbimento era effettivamente mediato dalla FC. Il saggio che abbiamo appena descritto ci permette di quantificare in modo specifico l'assorbimento di Tau mediato dagli anticorpi da microglia. I dati generati con questo saggio possono aiutare a chiarire il meccanismo d'azione degli anticorpi anti-Tau, rappresentando così uno strumento utile per far avanzare gli anticorpi anti-Tau per compiere ulteriori progressi nel loro sviluppo come potenziale trattamento ad AD.
