Ce protocole peut être appliqué avec succès à la fois pour induire la réponse inflammatoire et fibrotique importante dans les deux poumons par injection entéracheal de Bleomycin et pour valider de nouvelles thérapies systémiques anti-inflammatoires et anti-fibrotiques par infusion de veine de queue. Le principal avantage de cette technique est que l’injection directe de bleomycine dans la trachée de souris assure un ciblage rapide des poumons sans aucun déversement dans les voies respiratoires supérieures permettant une induction sûre, robuste et reproductible de l’inflammation pulmonaire et de la fibrose. Le Dr Fiorenza Orlando, médecin vétérinaire de notre laboratoire collaborateur, démontrera l’intervention.
Pour commencer, placez la souris anesthésiée couchée sur le dos sur une plate-forme chirurgicale. Fixez délicatement ses jambes avec des bandes de ruban chirurgicale pour la maintenir en place. Pour hyper étendre le cou de la souris, placez un support tel que le rouleau de coton dentaire sous sa région cervicale.
Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour raser doucement la gorge. Utilisez une paire de forceps anatomiques pour pincer la peau. Utilisez une paire de ciseaux contondants incurvés manipulés par anneau pour faire une incision courte d’environ un demi-centimètre de longueur en correspondance avec le muscle sternohyoïde de la souris.
Utilisez des bâtonnets de coton pour arrêter tout saignement. Puis extérioriser la trachée par dissection émoussée et la nettoyer délicatement de la graisse et d’autres tissus. Faites pivoter la plate-forme chirurgicale pour orienter la souris avec sa tête vers l’opérateur, ce qui permet à l’opérateur pendant l’injection d’angler correctement la seringue.
Pour visualiser la trachée, placez la souris sous un microscope d’opération. Réglez l’éclairage et réglez le grossissement entre 1 et 1,2 puis ajustez la mise au point et la netteté. La trachée peut être facilement distinguée comme un tube translucide blanc avec des anneaux trachéaux clairement visibles.
Pipette doucement pour mélanger la solution de Bleomycin et aspirer 100 microlitres dans une seringue de 0,5 millilitre avec une aiguille de calibre 25 évitant la formation de bulles. Une fois que la trachée est clairement visualisée, perforez-la soigneusement avec la pointe de l’aiguille à un angle de 30 degrés. Injectez lentement 100 microlitres de Bleomycine directement dans le lumen de la trachée.
Après avoir attendu quelques secondes que tout le volume descende l’aiguille, retirez-la de la trachée. Observez quelques secondes d’apnée se produire lorsque l’aiguille est correctement insérée dans la trachée indiquant que tout le volume de liquide a été inhalé. Jetez en toute sécurité la seringue et l’aiguille.
Fermez le fascia sous-cutané et la plaie cutanée avec une suture absorbable 5-0 et laissez l’animal récupérer. Après anesthésier la souris à nouveau et une fois que l’inconscience a été confirmée, placez la souris sous une hotte stérile. Utilisez un masque facial avec un débit continu de 1,5% d’isoflurane pour maintenir une anesthésie douce tout au long de l’expérience.
Pour favoriser la vasodilatation et faciliter l’injection, tremper la queue dans l’eau chaude pendant deux minutes. Mélanger une suspension des cellules stromales mésenchymales du cordon ombilical humain en pipetting doucement pour éviter la formation de touffes cellulaires. Aspirer 200 microlitres dans une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 26 évitant la formation de bulles.
Tenez la queue par la pointe et redressez-la doucement. Puis localiser la veine latérale de la queue. Grattez doucement la queue avec un scalpel et essuyez-la avec 70% d’éthanol.
À partir de la partie distale de la queue, insérer l’aiguille dans la veine à un angle de 15 degrés. Infuser lentement 200 microlitres de cellules stromales ombilicales humaines. Pour surveiller la perfusion intraveineuse réussie, observez le liquide entrant dans la veine sans résistance et un manque d’extravasation.
Après avoir attendu quelques secondes jusqu’à ce que tout le volume se déplace dans l’aiguille, retirez-la de la veine. Ensuite, appliquez brièvement une pression sur la plaie d’entrée avec une gaze stérile pour prévenir les saignements et permettre à l’animal de récupérer. Jeter en toute sécurité la seringue et l’aiguille après l’infusion.
Après injection de bleomycine, les changements histopathologiques de poumon ont été évalués par hematoxyline et eosin et coloration rouge de Picrosirius confirmant l’infiltration inflammatoire étendue et la fibrose comparées à l’architecture normale de poumon après injection saline. L’inflammation et la fibrose pulmonaires induites par la bléomycine ont été en grande partie atténuées par l’infusion mésenchymale de cellules stromal de cordon ombilical humain mais pas par l’infusion saline. Le dépôt de collagène a été mesuré par essai d’hydroxyproline.
Après l’injection de bleomycine, les niveaux d’hydroxyproline ont progressivement augmenté du jour huit au jour 14 et 21. Alors que l’ajout de cellules stromales mésenchymales du cordon ombilical humain a considérablement réduit les effets de la bléomycine. Les niveaux d’expression du gène col1A1 de collagène de type un dans l’ARNm pulmonaire entier ont également montré une augmentation progressive aux jours huit, 14 et 21 qui a été partiellement réduite par le traitement stromal mésenchymal de cordon ombilical humain.
L’immunostaining avec des anticorps spécifiques a prouvé que les cellules stromal mésenchymales humaines infusées de cordon ombilical ont rapidement et efficacement atteint des poumons de souris, bien que seulement quelques cellules aient été détectées. Ces données suggèrent une dislocation rapide des cellules des dommages de site en dépit de l’effet protecteur prolongé. L’utilisation d’un microscope d’exploitation assure une grande confiance dans le succès en permettant à l’opérateur de surveiller avec précision le placement correct de l’aiguille dans la trachée de souris avant l’installation, minimisant ainsi le risque de l’endommager.
