Este protocolo pode ser aplicado com sucesso tanto para induzir importante resposta inflamatória e fibrosa em ambos os pulmões por injeção endotraqueal de Bleomicina quanto para validar novas terapias sistêmicas anti-inflamatórias e anti-fibrosas por infusão de veias da cauda. A principal vantagem desta técnica é que a injeção direta de Bleomicina na traqueia do camundongo garante o direcionamento rápido dos pulmões sem derramamentos nas vias aéreas superiores permitindo indução segura, robusta e reprodutível de inflamação pulmonar e fibrose. Demonstrando o procedimento estará a Dra.
Para começar, posicione o rato anestesiado deitado de costas em uma plataforma cirúrgica. Fixar delicadamente as pernas com tiras cirúrgicas para mantê-la no lugar. Para hipersoar o pescoço do camundongo, coloque um suporte como rolo de algodão dental sob sua região cervical.
Em seguida, use uma lâmina de barbear para raspar suavemente a garganta. Use um par de fórceps anatômicos para beliscar a pele. Use um par de tesouras de corte curvas curvas do anel para fazer uma incisão curta de cerca de meio centímetro de comprimento em correspondência com o músculo esternoide do rato.
Use palitos de algodão para parar qualquer sangramento. Em seguida, exteriorize a traqueia por dissecção sem cortes e limpe-a suavemente de gordura e outros tecidos. Gire a plataforma cirúrgica para orientar o mouse com a cabeça em direção ao operador, o que permite ao operador durante a injeção angular corretamente a seringa.
Para visualizar a traqueia, coloque o mouse sob um microscópio operacional. Ajuste a iluminação e ajuste a ampliação entre 1 e 1.2 e ajuste o foco e a nitidez. A traqueia pode ser facilmente distinguida como um tubo translúcido branco com anéis traqueais claramente visíveis.
Pipeta suavemente para misturar a solução bleomicina e aspirar 100 microliters em uma seringa de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 25 evitando a formação de bolhas. Uma vez que a traqueia é claramente visualizada, furá-la cuidadosamente com a ponta da agulha em um ângulo de 30 graus. Injete lentamente 100 microliters de Bleomicina diretamente no lúmen da traqueia.
Depois de esperar alguns segundos para todo o volume viajar pela agulha, remova-o da traqueia. Observe alguns segundos de apneia ocorrendo quando a agulha é corretamente inserida na traqueia indicando que todo o volume de líquido foi inalado. Descarte com segurança a seringa e a agulha.
Feche a fáscia subcutânea e a ferida da pele com uma sutura absorvível de 5-0 e permita que o animal se recupere. Depois de anestesiar o rato novamente e uma vez que a inconsciência foi confirmada, coloque o rato sob um capô estéril. Use uma máscara facial com um fluxo contínuo de 1,5% de isoflurane para manter anestesia suave durante todo o experimento.
Para promover a vasodilatação e permitir uma injeção mais fácil, mergulhe a cauda em água morna por dois minutos. Misture uma suspensão de células estromais mesenquimais do cordão umbilical humano por tubos suavemente para evitar a formação de aglomerados celulares. Aspire 200 microliters em uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 26 evitando a formação de bolhas.
Segure a cauda pela ponta e endireitar delicadamente. Em seguida, localize a veia lateral da cauda. Raspe suavemente a cauda com um bisturi e limpe-a com 70% de etanol.
A partir da porção distal da cauda, insira a agulha na veia em um ângulo de 15 graus. Infundir lentamente 200 microliters de células mesenquimal do cordão umbilical humano. Para monitorar a infusão intravenosa bem sucedida, observe o líquido entrando na veia sem resistência e falta de extravasação.
Depois de esperar alguns segundos até que todo o volume desça pela agulha, remova-a da veia. Em seguida, aplique brevemente pressão na ferida de entrada com uma gaze estéril para evitar sangramento e permitir que o animal se recupere. Descarte com segurança a seringa e a agulha após a infusão.
Após a injeção de Bleomicina, as alterações histopatológicas pulmonares foram avaliadas por Hematoxilina e Eosina e Picrosirius Red, confirmando extensa infiltração inflamatória e fibrose em comparação com a arquitetura pulmonar normal após injeção salina. A inflamação pulmonar e a fibrose induzidas pela bleomicina foram em grande parte atenuadas pela infusão de células estrommais do cordão umbilical humano, mas não por soro fisiológico. A deposição de colágeno foi medida pelo ensaio hidroxiprolina.
Após a injeção de Bleomimicina, os níveis de hidroxiprolina aumentaram progressivamente dos dias oito para os dias 14 e 21. Considerando que a adição de células estrômicas mesenquimal do cordão umbilical humano reduziu significativamente os efeitos da Bleomimicina. Os níveis de expressão do gene col1A1 tipo um colágeno em mRNA pulmonar inteiro também mostraram um aumento progressivo nos dias oito, 14 e 21 que foi parcialmente reduzido pelo tratamento de células estrômicas mesenquimais do cordão umbilical humano.
Imunostaining com anticorpos específicos mostrou que infundiu células estromais do cordão umbilical humano rapidamente e efetivamente atingiu pulmões de camundongos, embora apenas algumas células foram detectadas. Esses dados sugerem uma rápida luxação das células da lesão do local, apesar do efeito protetor prolongado. O uso de um microscópio operacional garante alta confiança de sucesso, permitindo que o operador monitore com precisão a colocação correta da agulha na traqueia do mouse antes da instalação, minimizando assim o risco de danificá-la.
