이 프로토콜은 성공적으로 Bleomycin의 내트라큐트 주입에 의해 두 폐에서 중요한 염증 및 섬유성 반응을 유도하고 꼬리 정맥 주입에 의한 새로운 항 염증 및 항 섬유 성 전신 요법을 검증하기 위해 성공적으로 적용 될 수있다. 이 기술의 주요 장점은 마우스 기관으로 Bleomycin을 직접 주입하면 상부 기도에서 유출없이 폐를 신속하게 표적으로 하여 폐 염증 및 섬유증의 안전하고 견고하며 재현 가능한 유도를 한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 협력 실험실에서 수의학 의사 인 Fiorenza 올랜도 박사가 될 것입니다.
시작하려면 마취 된 마우스가 수술 플랫폼에 등에 누워 있는 것을 배치하십시오. 수술 용 테이프 스트립으로 다리를 섬세하게 고정하여 제자리에 고정하십시오. 마우스의 목을 하이퍼확장하려면 자궁 경부 부위 아래에 치과 용 면롤과 같은 지지체를 배치하십시오.
그런 다음 면도날을 사용하여 목을 부드럽게 면도합니다. 해부학 적 집게 한 켤레를 사용하여 피부를 꼬집습니다. 마우스 스테인로이드 근육에 대응하여 길이의 약 반 센티미터를 짧게 절개하기 위해 구부러진 무딘 가위를 다루는 링 한 쌍을 사용합니다.
면 봉을 사용하여 출혈을 막습니다. 그런 다음 무딘 해부에 의해 기관을 외부화하고 부드럽게 지방 과 다른 조직에서 청소. 수술 플랫폼을 회전하여 주사기를 제대로 각도로 전환할 수 있는 수술용 작업자가 작업자쪽으로 머리를 향하도록 합니다.
기관을 시각화하려면 작동 현미경 아래에 마우스를 배치합니다. 조명을 조정하고 1과 1.2 사이의 배율을 설정한 다음 초점과 선명도를 조정합니다. 기관체는 명확하게 보이는 기관 고리가있는 흰색 반투명 튜브로 쉽게 구별 될 수 있습니다.
부드럽게 파이펫은 Bleomycin 용액과 흡면 100 마이크로 리터를 0.5 밀리리터 주사기에 25 게이지 바늘로 거품 형성을 피합니다. 기관체가 명확하게 시각화되면 30도 각도로 바늘 끝으로 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 천천히 기관지의 루멘에 직접 Bleomycin의 100 마이크로 리터를 주입.
전체 부피가 바늘 아래로 이동하기 위해 몇 초를 기다린 후 기관에서 제거하십시오. 바늘이 기관체에 올바르게 삽입될 때 발생하는 몇 초 의 무호흡증을 관찰하여 전체 액체 부피가 흡입되었음을 나타냅니다. 주사기와 바늘을 안전하게 버리십시오.
피하 근막과 피부 상처를 5-0 흡수가능한 봉합사로 닫고 동물이 회복할 수 있도록 합니다. 마우스를 다시 마취한 후 의식이 확인되지 않은 후, 마우스를 멸균 후드 아래에 놓습니다. 실험 전반에 걸쳐 부드러운 마취를 유지하기 위해 1.5 %의 연속 흐름이있는 얼굴 마스크를 사용합니다.
혈관 확장을 촉진하고 쉽게 주입할 수 있도록 하려면 꼬리를 따뜻한 물에 2분 간 담급니다. 인간 탯줄 중간엽 기질 세포의 현탁액을 부드럽게 배관하여 세포 덩어리 형성을 피하십시오. 200 마이크로리터를 1밀리리터 주사기에 26게이지 바늘로 거품 형성을 피합니다.
끝에 꼬리를 잡고 부드럽게 곧게 펴십시오. 그런 다음 꼬리의 측면 정맥을 찾습니다. 꼬리를 메스로 부드럽게 긁어 70%에탄올로 닦으십시오.
꼬리의 말단 부분에서 시작하여 바늘을 15도 각도로 정맥에 삽입하십시오. 천천히 인간의 탯줄 중간엽 기질 세포의 200 마이크로 리터를 주입. 성공적인 정맥 주입을 모니터링하려면 저항과 사치부족 없이 정맥에 들어가는 액체를 관찰하십시오.
전체 부피가 바늘 아래로 이동할 때까지 몇 초를 기다린 후 정맥에서 제거하십시오. 그런 다음 출혈을 방지하고 동물이 회복 할 수 있도록 멸균 거즈로 엔트리 상처에 압력을 간략하게 적용하십시오. 주입 후 주사기와 바늘을 안전하게 폐기하십시오.
Bleomycin 주입 후, 폐 조직 병리학 적 변화는 식염수 주입 후 정상적인 폐 아키텍처에 비해 광범위한 염증 성 침투 및 섬유증을 확인하는 헤마톡시린과 에오신과 피코시리우스 레드 염색에 의해 평가되었다. Bleomycin 유도폐 염증 및 섬유증은 주로 인간 탯줄 중간엽 기질 세포 주입에 의해 감쇠되었지만 식염수에 의해 감쇠되었다. 콜라겐 증착은 하이드록시프린 분석에 의해 측정되었다.
Bleomycin 주입 에 따라, 하이드록시프린 수준은 점진적으로 8 일째에서 14 및 21로 증가했습니다. 인간 탯줄 중간엽 기질 세포의 첨가는 Bleomycin의 효력을 현저하게 감소했습니다. 전체 폐 mRNA에서 Col1A1 형 1형 콜라겐 유전자의 발현 수준은 또한 인간 탯줄 중간엽 기질 세포 처리에 의해 부분적으로 감소된 일 8, 14 및 21일에 점진적인 증가를 보여주었습니다.
특정 항체를 이용한 면역 염색은 몇몇 세포만 검출되었지만 인간 탯줄 중간엽 기질 세포를 신속하고 효과적으로 마우스 폐에 주입했다는 것을 보여주었습니다. 이 데이터는 장기간보호 효과에도 불구하고 사이트 부상에서 세포의 급속한 탈구를 건의합니다. 작동 현미경의 사용은 운전자가 정확하게 설치하기 전에 마우스 기관에 바늘의 정확한 배치를 모니터링 할 수 있도록하여 성공의 높은 자신감을 보장, 따라서 손상의 위험을 최소화.
