מחקרים אחרונים הדגישו את התפקיד הקריטי של אנגיוגנזה וחדשנות אוהדת בשיפוץ רקמת שומן במהלך התפתחות השמנת יתר. כאן אנו מדגימים שיטת immunofluorescence שונה כי ביעילות עומד כלי דם וסיבי עצב ברקמת שומן. הגישה שלנו היא ישר קדימה ויעיל ללא פשרות על יעילות עמידה ואיכות.
אנו רוכשים את התמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. הרזולוציה הגבוהה של התמונות מאפשרת לנו לשחזר את רשתות כלי הדם ולנתח במדויק את מאפייניה. התחל הליך זה עם הרדמה ו תדלוק של שישה שבועות C57 עכברים זכר שחור-6J כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
לנתח בעיות שומן לבן וחום מהעכברים. השתמש במספריים כדי לשבור את דגימות הרקמה לחתיכות קטנות של נתח. מעבירים את הגושים הקטנים עם פינצטה מעקרת לתוך תבשילי הטמיעת הרקמות עם תיוג נכון של דגימות הרקמה על הקלטות.
לטבול את הקלטות המוטבעות המכילות דגימות רקמה לתוך פתרון קיבוע בארבע מעלות צלזיוס במשך 24 עד 48 שעות. העברת הנתחים הקטנים הייתה פינצטה מעוקרת לצלחת פטרי. לשטוף את הדגימות 3 פעמים עם מברשת 1x חיץ PBS ב 0.5 מיליליטר לכל לשטוף.
עכשיו חותכים את דגימות הרקמה הקבועות לשתי קוביות מילימטר מעוקב עם המספריים המעוקרים. עבור permeabalisation, להעביר את הדגימות לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של 1% חיץ PBS טריטון בעדינות לסובב את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת ב 18 סל"ד. לאחר שעה להסיר בזהירות את חיץ 1% טריטון PBS על ידי שאיפה לשטוף את הדגימות שלוש פעמים על ידי הוספת PBS 1x ישירות לתוך אותם צינורות.
במהלך כל שטיפה, להפוך את הצינורות מספר פעמים. לחסימה, הוסיפו 0.5 מיליליטר של חיץ חסימה לדגימות ולאינקובטור בטמפרטורת החדר למשך שעתיים עם סיבוב עדין. כדי להכין 0.4 מיליליטר של פתרון נוגדנים ראשוני, לדלל שני microliters של אנטי אנדומוסין ושני microliters של נוגדני לאסה הידרוקסי אנטי טירוסין עד 396 microliters של חיץ חסימה.
מערבולת ולסובב למטה כדי לשחזר את עוצמת הקול. עכשיו, בזהירות להסיר את חוצץ החסימה מגמות הרקמות. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים הראשוני המוכן לצינורות ו דגירה בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.
למחרת, בזהירות לאסוף את פתרון הנוגדן העיקרי לשימוש חוזר אם תרצה. לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST 1x ב 500 ליטר לכל לשטוף במשך 30 דקות עם סיבוב עדין ב 18 סל"ד. להכנת פתרון נוגדנים משני, לדלל שני microlitres של קמח-קמלו גדוש נגד האל IGG בשני microlitres של קמחו-קמלו גדוש נגד כלבת IGG לתוך 396 microliters של חיץ חסימה.
מערבולת ולסובב בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזלים. עכשיו, להסיר את מאגר הכביסה האחרון מהדגימות. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים משני לצינורות.
הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים עם סיבוב עדין ב 18 סל"ד. לאחר הסרת פתרון הנוגדנים המשני בזהירות, שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBST 1x ב 500 microlitres לכל לשטוף במשך 30 דקות כל אחד עם סיבוב עדין ב 18 סל"ד. לקבלת אישור אופטי, לטבול את הדגימות במיליליטר אחד של 90% גליצרול ולשמור את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד שהם הופכים שקופים.
הוסף כאן מבודד סיליקון לשקופית כדי ליצור באר עבור דימות נפח. שמור על גובה הסיליקון או קצת פחות מזה של המדגם. מעבירים בזהירות את הדגימות לתוך הבאר וממלאים אותה במדיום ההרכבה.
מניחים כיסוי על פני השטח ואוטמים את רבעי הכיסוי עם צמיגות גבוהה בינונית. תן את התרופה בינונית הרכבה במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר וחושך. לאחר הריפוי הושלם, לאטום באופן מלא את הקצוות של coverslip עבור אריכות ימים מדגם אופטימלי.
רכוש תמונות מחסנית Z במטרה 20 פעמים של מיקרוסקופ קונפוקל והתוכנה המתאימה לו. הפעל את המערכת. לחץ על הכרטיסייה תצורה ולהפעיל הן את לייזר ארגון ואת לייזר He-Ne 633.
לחץ על הכרטיסיה רכישה. בלוח קווי הלייזר הגלויים, הזז את מחווני העוצמה המתאימים למעלה כדי לבחור את קווי הלייזר עד 488 ננומטר ו- 633 ננומטר. בתחילה ניתן להגדיר את התעצמויות 20 עד 30%Now לבחור את המראה 488, 561, 633 dichroic משולש.
הפעל את מכפילי התמונות על-ידי לחיצה על תיבות הסימון הפעילות. בחר photomultiplier אחד עבור הפליטה המופעלת על ידי לייזר ננומטר 488 ו photomultiplier 34 עבור זה של לייזר ננומטר 633. הגדר את טווח אורך הגל בין 500 ל 550 ננומטר עבור מכפיל תמונה אחד.
ב 650 עד 750 ננומטר, למכפיל תמונה שלוש. בחר את הצבע המדוקל שישמש לתצוגת תמונה על-ידי לחיצה כפולה על המלבן הצבעוני לצד כל מכפיל תמונה ובחירת צבע מהתפריט הנפתח. עכשיו לחץ על לחיות כדי לבדוק את התמונה בדגימות.
השתמש ב- nob מיקום Z כדי לבחור מישור מיקוד בתוך אזור ה- XY המעניין. כוונן את בהירות התמונות על-ידי הפיכת עוצמת הלייזר, הרווח החכם וההיסט. עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, בצע התאמה זו תחת מצב התצוגה המהיר של טבלת בדיקת המידע.
לחץ על כפתור חיפוש מהיר של הטבלה כדי להיכנס למצב טבלת בדיקת מידע מהירה שבו פיקסלים רוויים מוצגים בכחול כדי לסייע בהגדרה של רמת הבהירות המתאימה. לחץ פעמיים על כפתור חיפוש מהיר של הטבלה כדי לחזור למצב תצוגת צבע מדומה. במהלך הסריקה, סובב את ה- Nob של מיקום Z נגד כיוון השעון כדי להעביר את מישור המיקוד לקצה אחד של נפח העניין.
לאחר מכן לחץ על ראש החץ הקצה כדי להגדיר את הסריקה ואת המיקום. סובב את nob מיקום Z של בכיוון השעון כדי להעביר את מישור המיקוד דרך הדגימה לקצה השני של נפח העניין. לאחר מכן לחץ על ראש החץ התחל כדי להגדיר את מיקום התחלת הסריקה.
התאם את גודל שלב Z לשלושה מיקרון. שנה את איכות התמונה על-ידי בחירת תבנית של 1024 על 1024, מהירות של 100 הרץ וממוצע קו של שניים. בחר התחל כדי ליזום את רכישת תמונת מחסנית Z להקרנה מרבית של מחסנית התמונות שנרכשה, לחץ על הכרטיסיה תהליך ולאחר מכן הכלי;בחר הקרנה תלת-מימדית והזן מקסימום ברשימת השיטות ללא שינויים ב- X, Y ו- Z.Set סף לאפס, לחץ על החל.
העוצמה המרבית של אמצעי האחסון Z תיערם לתמונה דו-מימדית המוצגת. כדי לנתח את התמונות הדו-מימדיות באמצעות תוכנת קוד פתוח, פתח את התמונות המוערמות בתוכנה. התאימו את קוטר כלי השיט ואת עוצמתו עד שניתן יהיה לבחור כראוי את כל מבני כלי השיט.
בחר ניתוח הפעלה וייצא את הנתונים בהתאם להנחיית התוכנה. כדי לנתח את התמונות 3D באמצעות תוכנת הרישיון, לפתוח את הנתונים הגולמיים של תמונות עם התוכנה. התאימו את סף העוצמה ופרמטרים אחרים עד למבני הכלי בכל שכבה של אמצעי האחסון Z מחולקים כראוי.
שלד מחסנית התמונה binarised וכתוצאה מכך כדי לקבל גרף מיוחד. נתח את מאפייני המקטע הנבחר וייצא את הנתונים בהתאם להנחיית התוכנה. רקמת השומן הלבנה האפידימלית של האזור הדיסטלי, האזור המדיאלי של רקמת השומן הלבנה התת עורית הגבית האזור המדיאלי של רקמת השומן החום התוך-שסולרית נאספו.
לאחר כתם הר שלם, גזעי הרקמה היו רכובים ודמיין עם מיקרוסקופ confocal. כלי דם נוספים היו מוכתמים באופן חיובי. עם הנוגדן נגד אנדומוסין ברקמת השומן הלבנה התת עורית של הגליצרול, מה שמרמז על כך שצעד ההבהר חיוני להכתמה מלאה של כלי הדם.
כדי לקבוע אם כלי דם וסיבי עצב להפגין דפוסים שונים בין depos בשיטה זו, כתמי פלואורסצנטיות קהילתית בוצעה ברקמת שומן עם נוגדנים עם אנטי אנדומוסין כדי להראות כלי דם עם לאסה הידרוקסי אנטי טירוסין להראות סיבי עצב. מעניין, התוצאות מראות כי הם היו באופן משמעותי יותר כלי דם מאשר סיבי עצב ברקמת שומן חום לעומת רקמת שומן לבן. בין רקמת השומן הלבנה, רקמת השומן הלבן התת עורי הציגה צפיפות כלי דם גבוהה יותר מאשר רקמת השומן הלבנה האפידידימלית.
יש לציין, בעוד סיבי העצב התרחבו במקביל לכלי הדם, הם לא הוותו לוקליזציה משמעותית. אזור כלי השיט, מספר הצמתים ואורך הצינור נמדדו אז באופן איכותי בשיטת הדו-מימד בשלושת סוגי רקמת השומן הללו ומצאו תוצאות דומות. שיטה זו ביעילות cos-dens כלי דם וסיבי עצב ורקמות שומן.
זה נשמע ככלי שימושי לחקר השינוי הדינמי ברקמת השומן במהלך התפתחות השמנת יתר. היי-דה פה רב עוצמה הוא רעיל. נא לבצע P-IFA מעורבים צעדים במגע עור רחב יותר שאיפה כראוי להתמודד עם P-ifa כי קרני הלייזר הפכו מיקרוסקופ מוקד עדיין לפגוע בעין.
הימנע מחשיפה לעיניים אל הקורות המגיעות מהמטרה,
