Des études récentes ont mis en évidence le rôle critique de l’angiogenèse et de l’innovation sympathique dans le remodelage des tissus adipeux pendant le développement de l’obésité. Ici, nous démontrons une méthode d’immunofluorescence modifiée qui peuple efficacement les vaisseaux sanguins et les fibres nerveuses dans le tissu adipeux. Notre approche est simple et efficace, sans compromis sur l’efficacité permanente et la qualité.
Nous acquérons les images à l’aide de microscopie confoccale. La haute résolution des images nous permet de reconstituer les réseaux de vaisseaux sanguins et d’analyser avec précision ses caractéristiques. Commencez cette procédure avec l’anesthésie et la perfusion de six semaines C57 Souris mâles Noir-6J comme détaillé dans le protocole de texte.
Disséquer les problèmes d’adipeux blancs et bruns des souris. Utilisez des ciseaux pour briser les échantillons de tissus en petits morceaux. Transférer les petits morceaux avec les pinces stérilisées dans les cassettes d’intégration tissulaire avec l’étiquetage approprié des échantillons de tissus sur les cassettes.
Plongez les cassettes intégrées contenant des échantillons de tissus dans la solution de fixation à quatre degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Transférer les petits morceaux a été stérilisé pinces dans une boîte de Pétri. Lavez les échantillons 3 fois à l’aide d’un tampon 1x PBS à 0,5 millilitres par lavage.
Maintenant, coupez les échantillons de tissus fixes en cubes d’environ deux millimètres cubes avec les ciseaux stérilisés. Pour la perméabalisation, transférer les échantillons dans un tube de 1,5 millilitre contenant un millilitre de tampon Triton PBS de 1 % et faire pivoter doucement les tubes à température ambiante pendant 1 heure à 18 tr/min. Après une heure soigneusement enlever le tampon 1%Triton PBS par aspiration laver les échantillons trois fois en ajoutant le 1x PBS directement dans les mêmes tubes.
Au cours de chaque lavage, inverser les tubes plusieurs fois. Pour le blocage, ajouter 0,5 millilitre de tampon de blocage aux échantillons et incubateur à température ambiante pendant deux heures avec rotation douce. Pour préparer 0,4 millilitres de solution primaire d’anticorps, diluez deux microlitres d’anti-Endomusin et deux microlitres d’anticorps hydroxy hydroxy anti-tyrosine jusqu’à 396 microlitres de tampon de blocage.
Vortex et tourner vers le bas pour récupérer le volume. Maintenant, retirez soigneusement le tampon de blocage des morceaux de tissu. Ajouter 100 microlitres de la solution préparée anticorps primaires dans les tubes et incuber à quatre degrés celcius pendant la nuit.
Le lendemain, recueillez soigneusement la solution d’anticorps primaire pour la réutilisation si désiré. Lavez les échantillons trois fois avec 1x PBST à 500 micro litres par lavage pendant 30 minutes avec rotation douce à 18 RPM. Pour la préparation de la solution d’anticorps secondaires, diluer deux microlitres de flouro-flouro conjugué anti-dieu IGG dans deux microlitres de flouro-flouro conjugué iGG anti-enragé en 396 microlitres de tampon de blocage.
Vortex et tourner brièvement pour recueillir tout le liquide. Maintenant, retirez le dernier tampon de lavage des échantillons. Ajouter 100 microlitres de solution d’anticorps secondaire dans les tubes.
Incuber les échantillons à température ambiante pendant deux heures avec rotation douce à 18 RPM. Après avoir soigneusement enlevé la solution d’anticorps secondaire, lavez les échantillons trois fois avec 1x PBST à 500 microlitres par lavage pendant 30 minutes chacun avec rotation douce à 18 RPM. Pour le dégagement optique, immerger les échantillons dans un millilitre de 90% glycérol et garder les échantillons à quatre degrés celcius dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils deviennent transparents.
Ajoutez ici un isolateur de silicium à la diapositive pour créer un puits pour l’imagerie en volume. Gardez la hauteur du silicone à ou légèrement inférieure à celle de l’échantillon. Transférez soigneusement les échantillons dans le puits et remplissez-les avec le milieu de montage.
Déposer un coverslip sur la surface et sceller les quartiers du coverslip avec un milieu de viscosité élevé. Laissez le milieu de montage guérir pendant 24 heures à température ambiante et dans l’obscurité. Une fois le séchage terminé, scellez complètement les bords du coverslip pour une longévité optimale de l’échantillon.
Acquérir des images Z stack avec l’objectif 20 fois d’un microscope confocal et de son logiciel correspondant. Démarrez le système. Cliquez sur l’onglet configuration et activez à la fois le laser Argon et le laser He-Ne 633.
Cliquez sur l’onglet acquérir. Dans le panneau de lignes laser visibles, déplacez les curseurs d’intensité correspondants jusqu’à choisir les lignes laser jusqu’à 488 nanomètres et 633 nanomètres. Initialement, les intensités peuvent être réglées à 20 à 30%Maintenant, sélectionnez le miroir 488, 561, 633 triple dichroïque.
Activez les multiplicateurs photo en cliquant sur les cases à cocher actives. Choisissez le photomultiplier pour l’émission exercée par le laser de 488 nanomètres et le photomultiplier 34 pour celui du laser de 633 nanomètres. Réglez la plage de longueur d’onde entre 500 et 550 nanomètres pour le multiplicateur photo un.
En 650 à 750 nanomètres, pour le multiplicateur photo trois. Sélectionnez la pseudo couleur à utiliser pour l’affichage de l’image en cliquant doublement sur le rectangle coloré à côté de chaque multiplicateur photo et en choisissant une couleur dans le menu pop-up. Maintenant, cliquez sur en direct pour vérifier l’image sur les échantillons.
Utilisez le nob de position Z pour sélectionner un plan de mise au point dans la région d’intérêt XY. Ajustez la luminosité des images en tournant l’intensité laser, le gain intelligent et le décalage. Pour chaque canal de fluorescence, effectuez cet ajustement sous le mode d’affichage rapide de la table de recherche.
Cliquez sur le bouton de table rapide pour entrer dans le mode de table de recherche rapide dans lequel les pixels saturés sont affichés en bleu pour faciliter le réglage du niveau de luminosité approprié. Cliquez deux fois sur le bouton de table rapide pour revenir au mode pseudo affichage couleur. Lors de la numérisation, tournez la position Z nob dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour déplacer le plan de mise au point à une extrémité du volume d’intérêt.
Cliquez ensuite sur la pointe de flèche d’extrémité pour régler la numérisation et la position. Tournez le nob de position Z dans le sens des aiguilles d’une montre pour déplacer le plan de mise au point à travers le spécimen à l’autre extrémité du volume d’intérêt. Cliquez ensuite sur la pointe de flèche de départ pour définir la position de début de la numérisation.
Réglez la taille de l’étape Z à trois microns. Modifiez la qualité de l’image en sélectionnant un format de 1024 d’ici 1024, une vitesse de 100 Hz, et une moyenne de ligne de deux. Sélectionnez commencer à lancer l’acquisition d’image Z stack Pour la projection maximale de la pile d’images acquise, Cliquez sur l’onglet processus, puis l’outil;sélectionnez la projection 3D et entrez le maximum dans la liste de méthode sans modifications au seuil X, Y et Z.Set à zéro, cliquez sur appliquer.
L’intensité maximale du volume Z sera empilée dans une image 2D qui s’affiche. Pour analyser les images 2D via un logiciel open source, ouvrez les images empilées dans le logiciel. Ajuster le diamètre et l’intensité du navire jusqu’à ce que toutes les structures du navire puissent être correctement sélectionnées.
Sélectionnez l’analyse d’exécuter et exportez les données suivant les conseils du logiciel. Pour analyser les images 3D via le logiciel de licence, ouvrez les données brutes des images avec le logiciel. Ajustez le seuil d’intensité et d’autres paramètres jusqu’à ce que les structures du navire dans chaque couche du volume Z soient correctement segmentées.
Skeletonize la pile d’images binariised résultant pour obtenir un graphique spécial. Analyser les caractéristiques du segment sélectionnée et exporter les données suivant les conseils du logiciel. Le tissu adipeux blanc épididymal de région distale, la région médiale du tissu adipeux blanc subcutané lombaire dorsal et la région médiale du tissu adipeux brun intra-scapulaire ont été rassemblés.
Après une tache de montage entière, les troncs de tissu ont été montés et photographiés avec le microscope confocal. Plus de vaisseaux sanguins ont été positivement tachés. Avec l’anticorps anti-endomusine dans le tissu adipeux blanc sous-cutané incubé de glycérol, suggérant que l’étape de compensation soit critique pour la coloration complète des vaisseaux sanguins.
Pour déterminer si les vaisseaux sanguins et les fibres nerveuses présentent des modèles différents parmi les depos avec cette méthode, la coloration communale de fluorescence a été exécutée dans le tissu adipeux avec des anticorps avec l’anti-Endomusin pour montrer des vaisseaux sanguins et avec le lase hydroxy anti-tyrosine pour montrer des fibres nerveuses. Fait intéressant, les résultats montrent qu’ils étaient significativement plus de vaisseaux sanguins que les fibres nerveuses dans le tissu adipeux brun par rapport au tissu adipeux blanc. Parmi le tissu adipeux blanc, le tissu adipeux blanc sous-cutané a montré la densité plus élevée de vaisseau sanguin que le tissu adipeux blanc épididymal.
Fait à noter, bien que les fibres nerveuses se soient développées parallèlement aux vaisseaux sanguins, elles n’ont pas montré de co-localisation significative. La zone du navire, le nombre de jonctions et la longueur du tube ont ensuite été mesurés qualitativement avec la méthode 2D dans ces trois types de tissu adipeux et ont trouvé des résultats similaires. Cette méthode cos-dens efficacement les vaisseaux sanguins et les fibres nerveuses et les tissus adipeux.
Il semble comme un outil utile pour étudier le changement dynamique dans le tissu adipeux pendant le développement de l’obésité. Puissant hy-de bouche est toxique. S’il vous plaît effectuer P-ifa impliqués étapes dans un contact plus large de la peau A et et l’inhalation et bien gérer le P-ifa Parce que les faisceaux laser sont devenus microscope focal encore nuire à l’œil.
Évitez l’exposition oculaire aux faisceaux provenant de l’objectif,
