Недавние исследования подчеркнули важную роль ангиогенеза и симпатической инновации в адиповозной ткани ремоделирования во время развития ожирения. Здесь мы демонстрируем модифицированный метод иммунофлуоресценции, который эффективно стоит кровеносных сосудов и нервных волокон в жировой ткани. Наш подход является прямым и эффективным без какого-либо компромисса по эффективности и качеству.
Мы приобретаем изображения с помощью конфокальные микроскопии. Высокое разрешение изображений позволяет реконструировать сети кровеносных сосудов и точно проанализировать его характеристики. Начните эту процедуру с анестезии и перфузии шестинедельных мышей C57 Black-6J, как описано в текстовом протоколе.
Рассекают белые и коричневые жировые проблемы с мышами. Используйте ножницы, чтобы разбить образцы тканей на мелкие кусочки куска. Перенесите небольшие куски с стерилизованным пинцетом в ткань, встраивая кассеты с надлежащей маркировкой образцов тканей на кассетах.
Погрузите встроенные кассеты, содержащие образцы тканей, в раствор фиксации при четырех градусах по Цельсию в течение 24-48 часов. Передача небольших кусков была стерилизована пинцетом в чашку Петри. Вымойте образцы 3 раза с помощью буфера 1x PBS на 0,5 миллилитров за стирку.
Теперь разрежьте образцы фиксированной ткани примерно на два кубических миллиметра кубиками с стерилизованными ножницами. Для пермебализации перенесите образцы в 1,5 миллилитровую трубку, содержащую один миллилитр буфера 1%Triton PBS, и аккуратно поверните трубки при комнатной температуре в течение 1 часа при 18 об/мин. Через час тщательно удалите 1%Triton PBS буфер путем аспирации мыть образцы три раза, добавив 1x PBS непосредственно в те же трубы.
Во время каждой стирки, инвертировать трубки несколько раз. Для блокировки добавьте 0,5 миллилитра блокирующего буфера в образцы и инкубатор при комнатной температуре в течение двух часов с нежным вращением. Для приготовления 0,4 миллилитров первичного раствора антител разбавляют двумя микролитрами антиокомузына и двумя микролитров антитирозинового гидрокси-антитела до 396 микролитров блокирующего буфера.
Vortex и спина вниз, чтобы восстановить громкость. Теперь осторожно удалите блокирующий буфер из кусков ткани. Добавьте 100 микролитров подготовленного раствора первичных антител в трубки и инкубировать при четырех градусах цельсия на ночь.
На следующий день тщательно соберите первичный раствор антител для повторного использования при желании. Мыть образцы три раза с 1x PBST при 500 микро-литров на стирку в течение 30 минут с нежным вращением при 18 об/мин. Для приготовления вторичного раствора антител разбавить два микролитров flouro-flouro спряженных антибога IGG в двух микролитров flouro-flouro спряженных анти-бешеный IGG в 396 микролитров блокирующего буфера.
Vortex и спина кратко собрать всю жидкость. Теперь удалите последний буфер стирки из образцов. Добавьте в трубки 100 микролитров вторичного раствора антител.
Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение двух часов с нежным вращением при 18 об/мин. После тщательного удаления вторичного раствора антител, мыть образцы три раза с 1x PBST при 500 микролитров на стирку в течение 30 минут каждый с нежным вращением при 18 об/мин. Для оптического очистки, погрузить образцы в один миллилитр 90%глицерол и держать образцы на четыре градуса цельсия в темноте, пока они не станут прозрачными.
Добавьте здесь изолятор кремния к скольжению для того чтобы создать наилучшим образом для изображения тома. Держите высоту силикона или немного меньше, чем у образца. Аккуратно перенесите образцы в колодец и заполните его монтажной средой.
Положите крышку на поверхность и запечатать четверти крышки с высокой вязкости среды. Пусть монтаж среднего лечения в течение 24 часов при комнатной температуре и темноте. После завершения лечения, полностью запечатать края крышки для оптимального долголетия образца.
Приобрети изображения стека с целью 20 раз конфокального микроскопа и соответствующего программного обеспечения. Запустите систему. Нажмите на вкладку конфигурации и активируйте лазер Argon и лазер He-Ne 633.
Нажмите на вкладку приобретения. В видимой панели лазерных линий, переместить соответствующую интенсивность ползунки вверх, чтобы выбрать лазерные линии до 488 нанометров и 633 нанометров. Первоначально интенсивности могут быть установлены на 20 до 30%Теперь выберите 488, 561, 633 тройное дихроическое зеркало.
Активируйте мультипликаторы фотографий, нажав на активные чек-боксы. Выберите photomultiplier один для излучения, оказываемого 488 нанометровый лазер и photomultiplier 34 для этого из 633 нанометрового лазера. Установите диапазон длин волн до 500-550 нанометров для фото мультипликатора.
В 650 до 750 нанометров, для фото мультипликатор три. Выберите псевдоцвет, который будет использоваться для отображения изображения, дважды нажав на цветной прямоугольник рядом с каждым мультипликатором фотографии и выбрав цвет из всплывающего меню. Теперь нажмите на живой, чтобы проверить изображение на образцах.
Используйте nob положения q для того чтобы выбрать плоскость фокуса внутри область XY интереса. Отрегулируйте яркость изображений, повернув интенсивность лазера, интеллектуальную прибыль и смещение. Для каждого канала флуоресценции выполните эту регулировку в режиме быстрого отображения таблицы просмотра.
Нажмите на кнопку быстрого просмотра таблицы, чтобы войти в режим быстрого просмотра таблицы, в котором насыщенные пиксели отображаются синим цветом, чтобы помочь настройке соответствующего уровня яркости. Нажмите дважды на кнопку быстрого просмотра таблицы, чтобы вернуться в режим псевдоцветного отображения. При сканировании поверните nob положения nob по часовой стрелке, чтобы переместить плоскость фокусировки на один конец объема интереса.
Затем нажмите на конец наконечника стрелы, чтобы установить сканирование и положение. Поверните nob положения q по часовой стрелке для того чтобы двинуть плоскость фокуса через образец к другому концу тома интереса. Затем нажмите на наконечник стрелки, чтобы установить начало сканирования позиции.
Отрегулируйте размер шага до трех микрон. Измените качество изображения, выбрав формат 1024 к 1024 году, скорость 100 Гц и среднюю линию в два. Выберите начало инициировать приобретение изображения стека для максимальной проекции приобретенного стека изображений, Нажмите на вкладку процесса, а затем инструмент;выберите 3D проекцию и введите максимум в списке методов без изменений в порог x, Y и q.Set до нуля, нажмите на применить.
Максимальная интенсивность громкости q будет уложена в 2D-изображение, которое отображается. Для анализа 2D-изображений с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом откройте сложенные изображения в программном обеспечении. Отрегулируйте диаметр и интенсивность сосуда до тех пор, пока не будут правильно выбраны все структуры сосудов.
Выберите анализ запуска и экспорт данных в соответствии с рекомендациями программного обеспечения. Для анализа 3D-изображений с помощью лицензионного программного обеспечения откройте необработанные данные изображений с помощью программного обеспечения. Отрегулируйте порог интенсивности и другие параметры до тех пор, пока структуры сосудов в каждом слое объема не будут должным образом сегментированы.
Скелетизировать полученный стек binarised изображения для получения специального графика. Проанализируйте выбранные характеристики сегмента и экспортируйте данные по указанию программного обеспечения. Были собраны дистальная область эпидидимальной белой жировой ткани, медиальная область спинной поясничной подкожной белой жировой ткани и медиальная область внутрикапулярной коричневой жировой ткани.
После целого монтажа окрашивания стволы тканей были установлены и изображены с помощью конфокального микроскопа. Больше кровеносных сосудов были положительно окрашены. С анти-эндомузын антитела в глицерол инкубируется подкожной белой жировой ткани, предполагая, что очистка шаг имеет решающее значение для полного окрашивания кровеносных сосудов.
Чтобы определить, являются ли кровеносные сосуды и нервные волокна проявляют различные модели среди свержения с помощью этого метода, коммунальные флуоресценции окрашивания была выполнена в жировой ткани с антителами с анти-эндомузин, чтобы показать кровеносные сосуды и с антитирозин гидроксиной лазе, чтобы показать нервных волокон. Интересно, что результаты показывают, что они были значительно больше кровеносных сосудов, чем нервные волокна в коричневой жировой ткани по сравнению с белой жировой ткани. Среди белой жировой ткани, подкожная белая жировая ткань выставлена более высокая плотность кровеносных сосудов, чем эпидидимальная белая жировая ткань.
Следует отметить, что, хотя нервные волокна расширялись параллельно кровеносным сосудам, они не проявили значительной совместной локализации. Площадь сосуда, количество соединений и длина трубки были затем качественно измерены с помощью 2D-метода в этих трех типах жировой ткани и обнаружили аналогичные результаты. Этот метод эффективно cos-дены кровеносных сосудов и нервных волокон и жировой ткани.
Это звучит как полезный инструмент для изучения динамических изменений в жировой ткани во время развития ожирения. Мощный рот hy-de является токсичным. Пожалуйста, выполнить P-ifa участие шаги в более широкий контакт кожи и и ингаляции и должным образом обрабатывать P-ifa Потому что лазерные лучи стали фокусный микроскоп еще вред глазу.
Избегайте воздействия глаз на лучи, поступающие от цели,
