Recenti studi hanno evidenziato il ruolo critico dell'angiogenesi e dell'innovazione simpatica nel rimodellamento dei tessuti adiposi durante lo sviluppo dell'obesità. Qui dimostriamo un metodo di immunofluorescenza modificato che sostiene in modo efficiente i vasi sanguigni e le fibre nervose nel tessuto adiposo. Il nostro approccio è semplice ed efficiente senza compromessi sull'efficienza e sulla qualità in piedi.
Acquisiamo le immagini usando la microscopia confocale. L'alta risoluzione delle immagini ci consente di ricostruire le reti dei vasi sanguigni e analizzarne accuratamente le caratteristiche. Inizia questa procedura con anestesia e perfusione di topi maschi C57 Black-6J di sei settimane come descritto nel protocollo di testo.
Sezionare problemi di adiposo bianco e marrone dai topi. Usa le forbici per rompere i campioni di tessuto in piccoli pezzi di grosso. Trasferire i piccoli pezzi con le pinzette sterilizzate nelle cassette di incorporamento dei tessuti con una corretta etichettatura dei campioni di tessuto sulle cassette.
Immergere le cassette incorporate contenenti campioni di tessuto nella soluzione di fissazione a quattro gradi celsius per 24-48 ore. Trasferire i piccoli pezzi è stata sterilizzata una pinzetta in una piastra di Petri. Lavare i campioni 3 volte con spazzola 1x tampone PBS a 0,5 millilitri per lavaggio.
Ora taglia i campioni di tessuto fissi in circa due cubi cubici millimetri con le forbici sterilizzate. Per la permeabalizzazione, trasferire i campioni in un tubo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di tampone PBS 1%Triton e ruotare delicatamente i tubi a temperatura ambiente per 1 ora a 18 giri/min. Dopo un'ora rimuovere con cura il tampone PBS 1%Triton per aspirazione lavare i campioni tre volte aggiungendo il PBS 1x direttamente negli stessi tubi.
Durante ogni lavaggio, invertire i tubi più volte. Per il blocco, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di blocco ai campioni e all'incubatore a temperatura ambiente per due ore con una rotazione delicata. Per preparare 0,4 millilitri di soluzione anticorpale primaria, diluire due microlitri di anti endomusina e due microlitri di anticorpi anti-tirosina idrossisi lasi fino a 396 microlitri di tampone di blocco.
Vortice e spin-down per recuperare il volume. Ora, rimuovere con cura il tampone di blocco dai blocchi di tessuto. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpi primari preparati in tubi e incubare a quattro gradi celcius durante la notte.
Il giorno successivo, raccogliere attentamente la soluzione di anticorpi primari per il riutilizzo, se lo si desidera. Lavare i campioni tre volte con 1x PBST a 500 micro litri per lavaggio per 30 minuti con rotazione delicata a 18 giri/min. Per la preparazione della soluzione di anticorpi secondari, diluire due microlitri di IGG coniugato flouro-flouro in due microlitri di IGG coniugato in 396 microlitri di tampone di blocco.
Vortice e girare brevemente per raccogliere tutto il liquido. Ora, rimuovere l'ultimo buffer di lavaggio dai campioni. Aggiungere 100 microlitri di soluzione anticorpale secondaria in tubi.
Incubare i campioni a temperatura ambiente per due ore con una rotazione delicata a 18 giri/min. Dopo aver rimosso con cura la soluzione anticorpale secondaria, lavare i campioni tre volte con 1x PBST a 500 microlitri per lavaggio per 30 minuti ciascuno con una rotazione delicata a 18 giri/min. Per il gioco ottico, immergere i campioni in un millilitro di 90%Glicerolo e mantenere i campioni a quattro gradi celcius nell'oscurità fino a quando non diventano trasparenti.
Aggiungere qui un isolatore di silicio alla diapositiva per creare un pozzo per l'imaging del volume. Mantenere l'altezza del silicone o leggermente inferiore a quella del campione. Trasferire con cura i campioni nel pozzo e riempirli con il mezzo di montaggio.
Posare un coverslip sulla superficie e sigillare i quarti del coverslip con mezzo ad alta viscosità. Lasciare che il mezzo di montaggio curi per 24 ore a temperatura ambiente e oscurità. Al termine della polimerizzazione, sigillare completamente i bordi del coverslip per una longevità ottimale del campione.
Acquisisci le immagini dello stack Z con l'obiettivo 20 volte superiore di un microscopio confocale e il relativo software. Avviare il sistema. Fare clic sulla scheda di configurazione e attivare sia il laser Argon che il laser He-Ne 633.
Fare clic sulla scheda acquisisci. Nel pannello delle linee laser visibili, spostare i cursori di intensità corrispondenti verso l'alto per scegliere le linee laser verso l'alto di 488 nanometri e 633 nanometri. Inizialmente le intensità possono essere impostate su 20-30%Ora selezionare lo specchio dicroico triplo 488, 561, 633.
Attivare i moltiplicatori di foto cliccando sulle caselle di controllo attive. Scegli ne fotomoltiplicatore uno per l'emissione esercitata dal laser da 488 nanometri e dal fotomoltiplicatore 34 per quella del laser a 633 nanometri. Impostare l'intervallo di lunghezza d'onda tra 500 e 550 nanometri per uno moltiplicatore di foto.
In 650-750 nanometri, per il moltiplicatore fotografico tre. Selezionare lo pseudocolore da utilizzare per la visualizzazione dell'immagine facendo doppio clic sul rettangolo colorato accanto a ogni moltiplicatore di foto e scegliendo un colore dal menu a comparsa. Ora fai clic sul live per controllare l'immagine nei campioni.
Utilizzate il nob posizione Z per selezionare un piano di messa a fuoco all'interno della regione di interesse XY. Regola la luminosità delle immagini ruotando l'intensità del laser, il guadagno intelligente e l'offset. Per ogni canale di fluorescenza, eseguire questa regolazione sotto la modalità di visualizzazione rapida della tabella di ricerca.
Fare clic sul pulsante della tabella di ricerca rapida per accedere alla modalità tabella di ricerca rapida in cui i pixel saturi vengono visualizzati in blu per aiutare l'impostazione del livello di luminosità appropriato. Fare clic due volte sul pulsante della tabella di ricerca rapida per tornare alla modalità di visualizzazione pseudocolore. Durante la scansione, ruotare il nob di posizione Z in senso antiorario per spostare il piano di messa a fuoco su un'estremità del volume di interesse.
Quindi fare clic sulla punta della freccia finale per impostare la scansione e la posizione. Ruotare il nob di posizione Z in senso orario per spostare il piano di messa a fuoco attraverso il campione fino all'altra estremità del volume di interesse. Quindi fare clic sulla punta della freccia iniziale per impostare la posizione iniziale della scansione.
Regolare la dimensione del passo Z su tre micron. Modificare la qualità dell'immagine selezionando un formato di 1024 entro 1024, una velocità di 100 Hz e una media di linea di due. Selezionare Avvia per avviare l'acquisizione dell'immagine dello stack Z Per la proiezione massima dello stack di immagini acquisito, fare clic sulla scheda processo e quindi selezionare la proiezione 3D e immettere il massimo nell'elenco dei metodi senza modifiche a X, Y e Z.Impostare la soglia su zero, fare clic su applica.
L'intensità massima del volume Z verrà impilata in un'immagine 2D visualizzata. Per analizzare le immagini 2D tramite software open source, apri le immagini impilate nel software. Regolare il diametro e l'intensità del contenitore fino a quando tutte le strutture dei vasi non possono essere selezionate correttamente.
Selezionare Esegui analisi ed esporta i dati seguendo le indicazioni del software. Per analizzare le immagini 3D tramite il software di licenza, aprire i dati grezzi delle immagini con il software. Regolare la soglia di intensità e altri parametri fino a quando le strutture del recipiente in ogni strato del volume Z non vengono segmentate correttamente.
Scheletrare lo stack di immagini binarie risultante per ottenere un grafico speciale. Analizzare le caratteristiche del segmento selezionato ed esportare i dati seguendo le indicazioni del software. Sono stati raccolti il tessuto adiposo bianco epididimale della regione distale, la regione mediale del tessuto adiposo bianco sottocutaneo lombare dorsale e la regione mediale del tessuto adiposo bruno intra-scapolare.
Dopo un'intera colorazione del supporto, i tronchi di tessuto sono stati montati e immagini con il microscopio confocale. Altri vasi sanguigni erano macchiati positivamente. Con l'anticorpo anti-endomusina nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo incubato dal glicerolo, suggerendo che il passaggio di compensazione è fondamentale per la colorazione completa dei vasi sanguigni.
Per determinare se i vasi sanguigni e le fibre nervose mostrano diversi modelli tra i depos con questo metodo, la colorazione della fluorescenza comune è stata eseguita nel tessuto adiposo con anticorpi con anti-endomusina per mostrare i vasi sanguigni e con lasi idrossido anti-tirosina per mostrare le fibre nervose. È interessante notare che i risultati mostrano che erano significativamente più vasi sanguigni rispetto alle fibre nervose nel tessuto adiposo marrone rispetto al tessuto adiposo bianco. Tra il tessuto adiposo bianco, il tessuto adiposo bianco sottocutaneo mostrava una densità dei vasi sanguigni più alta rispetto al tessuto adiposo bianco epididimico.
Da notare, mentre le fibre nervose si espansero in parallelo con i vasi sanguigni, non mostravano una significativa co-localizzazione. L'area del recipiente, il numero di giunzioni e la lunghezza del tubo sono stati quindi misurati qualitativamente con il metodo 2D in questi tre tipi di tessuto adiposo e hanno trovato risultati simili. Questo metodo cos-denisce in modo efficiente i vasi sanguigni e le fibre nervose e il tessuto adiposo.
Sembra uno strumento utile per studiare il cambiamento dinamico nel tessuto adiposo durante lo sviluppo dell'obesità. Potente hy-de bocca è tossico. Si prega di eseguire p-ifa coinvolti passi in un contatto cutaneo più ampio e e inalazione e gestire correttamente il P-ifa Perché i raggi laser sono diventati microscopio focale ma danneggiano l'occhio.
Evitare l'esposizione degli occhi alle travi provenienti dall'obiettivo,
