המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להשתמש בכוח של גנטיקה קדימה כדי לזהות גנים אשר כאשר dysregulated להוביל ניוון עצבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת גישה משוחדת וישירה לזיהוי גנים נוירו-מוגנים אשר עשוי להיות קשה יותר לבצע במודלים יונקים. טכניקה זו יכולה לשמש לזיהוי גנים חדשניים המעורבים בתהליך של ניוון עצבי אשר קשורה עם מחלות רבות כגון אלצהיימר ומחלת פרקינסון.
בנוסף לזיהוי גנים neuroprotective, הגישה הגנטית קדימה ניתן להשתמש כדי לגלות גנים המעורבים בתהליכים ביולוגיים אחרים כגון תפקוד עצבי והעברת. כדי להתחיל, לאסוף זבובים הומוזיגים מקווים השייכים לאוסף מוטציה ENU של מוטציות Drosophila ממופה כרומוזום השני. הופכים את הזבובים בגילאי 10 עד 12 ימים לתא בדיקה ללא הרדמה שורה אחת בכל פעם ומאפשרים להם להתאושש במשך חמש דקות.
כאשר קו ה-5 ס"מ מסמן את הצד כלפי מטה, הקש בכוח על התא שלוש פעמים על משטח עכבר שהונח על משטח מוצק, כך שכל הזבובים יתחילו את ההסתערות בתחתית. שימו לב לקטר זבובים על פני תקופה של 10 שניות. רשום את מספר הזבובים להגיע או לעבור את קו חמישה סנטימטרים בתוך זמן זה, כמו גם את המספר הכולל של זבובים שנבדקו.
המתן דקה אחת לפני שתתחיל משפט שני. חזור על מינימום של שלושה שכפולי ניסיון בכל שורה. לאחר הרדמה הזבובים על כרית פחמן דו חמצני, לנתק את הראשים לטוס עם להב כירורגי ולהשתמש מכחול בעדינות למקם אותם במיליליטר אחד של קיבוע של קרנוי בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
ואז לאחסן את הצינור בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת, ודאו שהראשים שקועים בפתרון התיקון. מתחת למכסה המנוע של האדים, השתמשו בפיקט P1000 כדי להחליף את הפתרון המקבע במיליליטר אחד של 70%אתנול ולתחזק את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס לניתוח עתידי.
באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את הראשים קבועים לתוך קלטות microbiopsy ולסגור את הקלטות. שלח את הקלטות למתקן היסטולוגיה לעיבוד או מקם אותן במכונת עיבוד רקמות אוטומטית אם הן זמינות באתר. הפעל את התוכנית כדי להתייבש, לנקות ולחדור את הראשים עם פרפין.
לאחר מכן מעבירים את הקלטות לתחנת הטמע פרפין עם פרפין מחומם ב 60 מעלות צלזיוס ומ מניחים תבניות בסיס מתכת שמתאימות לקלטות בתחנה המחוממת. השתמש מדפים עדין לכוון את הראשים כך שהם פונים העליון בתבנית הבסיס. אוריינטציה נכונה של הראש היא קריטית לניתוח ההיסטולוגיה.
לאחר התקשות, לקצץ כל בלוק פרפין כדי למזער את פני השטח כי יהיה חתך. חותכים חמישה מקטעי מיקרומטר של כל בלוק על המיקרוטום. לאחר מכן, מניחים את סרטי הפרפין חתוכים באמבט מים מחומם ב 35 מעלות צלזיוס לכל היותר חמש דקות.
טבול מגלשה מצופה פוליזין באמבט המים המחומם ולהשתמש במוליך עץ כדי למקם את הסרטים חתוך על המגלשה. תן לשקופיות להתייבש באוויר לילה בטמפרטורת החדר. למחרת, השתמש שקופיות חם יותר לחמם את המגלשות במשך 15 דקות ב 63 מעלות צלזיוס.
מתחת למכסה המנוע של האדים, מניחים את המגלשות על מתלה מכתים שקופיות ומניחים את המדף בהיסטוצ'וס במשך חמש דקות פעמיים ואחריו מספר אתנול וטיפולי אמבט מים מזוקקים על פי כתב היד. מעבירים את המדף למיכל מלא בהמטוקסילין האריס למשך שתיים עד חמש דקות כדי להכתים. לאחר מכן מוציאים את המדף מתסריט המטוקסילין ומ מניחים אותו תחת מי ברז זורמים במשך 10 דקות לפני צעדי הכתם הבאים.
לאחר הכתם, באמצעות מדפים, להוציא את השקופיות מתוך הפתרון HistoChoice או Xylene. מטפטף שכבה דקה של מדיום הרכבה קבוע על המדגם בעדינות מניחים כיסוי על החלק העליון. הימנע היווצרות של בועות.
לאחר המדיום הרכבה הוא התקשה, למקם את השקופית תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבל תמונות של חלקי המוח מייצג בערך midbrain. ראשית, הכינו מזון המכיל בקבוקון ליצירת זבובים נקביים הטרוזיגים. לאחר הרדמה של פחמן דו חמצני, השתמש במברשת צבע כדי להעביר חמישה זכרים של קו המוטנטים ו -10 נקבות בתולות של האונה התקועה בעצם החזה ולהצמיד מעל קו קרלי O לתוך הבקבוקון כדי להפוך את הצלב.
מניחים את הבקבוקון על 25 מעלות צלזיוס. לאחר 10 עד 12 ימים, לאסוף לפחות 15 צאצאים נקבה בתולה נושאת כרומוזום מוטציה כרומוזום הסמן. לחצות אותם לחמישה זכרים מ קו מאוזן שנושא עוד סמן דומיננטי גלוי קרלי O מעל scutoid או שווה ערך.
לאחר 10 עד 12 ימים, לאסוף את צאצאי זכר הטרוזיגוס נושאת או scutoid או קרלי O ואת כרומוזום recombined פוטנציאלי מן הצלב. חבר אותם בנפרד לנקבות בתולות מהמלאי הנושאות את הכרומוזום שעבר מוטציה. עשרה עד 12 ימים לאחר מכן, לאסוף את צאצאים מן הצלב האחרון לתוך מזון חדש המכיל בקבוקונים גיל זבובים ב 29 מעלות צלזיוס עד 10 עד 14 ימים.
בצע היסטולוגיה על ראשי זבובים וחזור על צאצאים של כל צלב בודד. עם מידע זה, לבצע מיפוי מחסור על אזור צר של הכרומוזום כדי לחדד את המיקום של מוטציה רצסיבית. לכל קו מחסור יש מחיקה של אזורים שונים בכרומוזומים המאפשרים להם לשמש לבדיקות משלימות.
לאחר מכן, לחצות קווים מתוך ערכת מחסור Drosophila עבור הכרומוזום השני ולחפש אי השלמה של פנוטיפ של הריבית. כדי לקבל התייחסות לניתוח רצף DNA, הורד קובץ בפורמט FASTA המכיל את רצף הקונצנזוס הגנומי של גן BRAT מ- FlyBase או השתמש בקובץ המכיל תוצאות עבור רצף BRAT של בקרת רקע גנטית, למשל קו דרוסופילה שעבר מוטציה במקור. פתח קבצי רצף בעורך פלסמיד A.
עבור אל עריכה ולחץ על ישר רצפים. באמצעות עכבר המחשב, בחר את כל הרצפים להשוואה. בתפריט הנפתח, ציין את רצף ההפניות עבור יישור זה.
בדוק את האזור ברצף עבור שינויים נוקלאוטיד בהשוואה לרצף ההפניה. אם תרצה, שמור את היישור במחשב בתבנית RTF על-ידי לחיצה על טקסט ולאחר מכן שמור. בצע את ניסוי ההצלה על ידי איסוף צאצאים F1 מכל צלב.
בחר בקפידה מאזנים מסומנים. גיל הזבובים על מזון Drosophila בינוני ב 29 מעלות צלזיוס ולבצע ניתוח היסטולוגיה על המוח לחפש ניוון עצבי כמו קודם לכן. כדי לבצע ניתוח תלוי גיל של ניוון עצבי ב 867 מוטציות, גיל זבובים לחמישה, 15 ו 25 ימים ולבצע ניתוח היסטולוגיה הבאים.
פרוטוקול זה מציג גישה גנטית קדימה למסך באמצעות אוסף של זבובים מוטגנים כימית באמצעות בדיקה מטפסת. מבין 235 קווים הומוזיגים, כ-37% מהקווים שנבדקו הציגו שיעור מעבר טיפוס נמוך מ-50% כאשר נבדקו בגיל 10 עד 12 ימים. מסך היסטולוגי עוקב על 51 של הקווים המציגים את שיעור עובר הטיפוס הנמוך ביותר גילה כי 29 של קווים אלה הראו מראה גלוי של חורים נוירופיל במוח החל מתון עד חמור אינדיקציה של ניוון עצבי.
פנוטיפ הנוירוזגנרציה ב-867 זבובים הוא רצסיבי מכיוון שמוחם של 867 זבובים הטרוזיגים שנחצו לזן פראי היו דומים לאלה של פקדים. קו המחסור Df24116 אינו משלים את פנוטיפ המוטנטים 867 המבוסס על מוסט הטיפוס. אימות היסטולוגי מראה את קו מחסור Df24116 אינו משלים את פנוטיפ ניוון עצבי 867 ואילו Df9296 עושה.
בחינת פנוטיפ המוח של 867 מוטנטים חצו לקווי מחסור נוספים אישרה כי המוטציה כלולה באזור הגנום הכולל את הגן BRAT. חשוב לזכור במהלך הליך זה לעבוד בקפדנות ובדיוק ככל האפשר כמו פרוטוקול זה משלב מספר שלבים אשר אם מבוצע כראוי יכול להשפיע על זיהוי של מוטנטים עם ניוון עצבי בגנים מועמדים. בהתאם לגנים שזוהו, ניתוח עוקב יכול לכלול בדיקת ביציות נוספות של הגן של העניין או אינטראקציות עם גנים המשחקים תפקיד במסלולים ידועים של ניוון עצבי.
במהלך ההליך ההיסטולוגי, זכור לטפל בפתרון התיקון של Carnoy בזהירות שכן הוא מכיל כלורופורם. ללבוש כפפות ולהשתמש עם אוורור נאותה באופן אידיאלי מתחת למכסה המנוע אדים. באופן דומה, לבצע את כל הכתמים ההיסטולוגיה מתחת למכסה המנוע אדים.
