이 프로토콜의 주요 목표는 소화 조절시 신경 변성으로 이끌어 내는 유전자를 확인하기 위하여 전진 유전학의 힘을 이용하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 포유류 모델에서 수행하기가 더 어려울 수 있는 신경 보호 유전자의 식별을 위한 편견없고 간단한 접근을 제공한다는 것입니다. 이 기술은 알츠하이머병과 파킨슨 병과 같은 많은 질병 조건과 관련된 신경 변성 과정에 연루 된 새로운 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
신경 보호 유전자를 식별하는 것 외에도, 앞으로 유전적 접근법은 신경 기능 및 전염과 같은 다른 생물학적 과정에 관련된 유전자를 발견하는 데 사용될 수 있습니다. 시작하려면, 두 번째 염색체에 매핑 드로소필라 돌연변이의 ENU 돌연변이 컬렉션에 속하는 라인에서 동질 화 파리를 수집합니다. 10~12일 의 파리를 한 번에 한 줄에 마취하지 않고 시험실로 뒤집어 5분 동안 회복할 수 있도록 합니다.
5센티미터 선 마크 면을 아래로 향하게 하면 단단한 표면에 놓인 마우스 패드에서 챔버를 세 번 탭하여 모든 파리가 아래쪽의 분석서를 시작합니다. 10초 동안 비행 운동을 관찰합니다. 이 시간 내에 5센티미터 라인에 도달하거나 통과하는 파리 의 수와 테스트된 총 비행 수를 기록합니다.
두 번째 시험을 시작하기 전에 1분 동안 기다립니다. 줄당 최소 세 개의 평가판 복제를 반복합니다. 이산화탄소 패드에서 파리를 마취한 후 수술용 블레이드로 머리를 자르고 페인트 브러시를 사용하여 1.5 밀리리터 마이크로센티리후지 튜브에 카르노이의 고정1밀리리터에 부드럽게 넣습니다.
그런 다음 튜브를 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 다음 날, 머리가 고정 솔루션에 침몰되어 있는지 확인합니다. 연기 후드 아래에서 P1000 파이펫을 사용하여 고정 용액을 70%에탄올의 1밀리리터로 대체하고 향후 분석을 위해 샘플을 섭씨 4도에서 유지합니다.
파스퇴르 파이펫을 사용하여 고정 된 머리를 미생물 카세트로 옮기고 카세트를 닫습니다. 카세트를 처리하기 위해 조직학 시설로 보내거나 현장에서 사용할 수 있는 경우 자동화된 조직 처리 기계에 넣습니다. 프로그램을 실행하여 파라핀으로 머리를 탈수하고 명확하고 침투합니다.
그런 다음 카세트를 파라핀 포함 스테이션으로 옮기고 파라핀이 섭씨 60도에서 가열되어 가열된 스테이션의 카세트에 맞는 금속 베이스 몰트를 배치합니다. 미세한 집게를 사용하여 헤드를 방향을 지정하여 기본 금형의 상단을 향하도록 합니다. 적절한 헤드 방향은 히스토로지 분석에 매우 중요합니다.
경화 후 각 파라핀 블록을 트리밍하여 단면화되는 표면을 최소화합니다. 마이크로톤에 각 블록의 5 마이크로미터 섹션을 잘라. 다음으로 단면파라핀 리본을 섭씨 35도의 온수 욕조에 최대 5분간 놓습니다.
가열 된 수조에 폴리 리신 코팅 슬라이드를 침지하고 나무 어플리케이터를 사용하여 섹션 리본을 슬라이드에 놓습니다. 실온에서 밤새 공기를 건조하게 하십시오. 다음 날, 슬라이드 워머를 사용하여 섭씨 63도에서 15 분 동안 슬라이드를 가열하십시오.
연기 후드 아래에 슬라이드를 슬라이드 염색 선반에 놓고 5 분 동안 HistoChoice에 랙을 두 번 놓고 원고에 따라 여러 에탄올과 증류 수조 트리트먼트를 제공합니다. 랙을 해리스 헤마톡슬린이 가득 찬 용기에 넣고 2~5분 간 얼룩지게 합니다. 그런 다음 Hematoxylin 용액에서 랙을 꺼내 다음 염색 단계 전에 10 분 동안 흐르는 수돗물 아래에 놓습니다.
염색 후, 집게를 사용하여, 히스토초이스 또는 자일렌 용액에서 슬라이드를 꺼내. 시료에 영구 장착 매체의 얇은 층을 드립하 고 부드럽게 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 거품의 형성을 피하십시오.
장착 매체가 경화된 후, 슬라이드를 가벼운 현미경 아래에 놓고 약 중뇌에서 대표적인 뇌 섹션의 이미지를 얻습니다. 첫째, 이종화구균 암컷 파리를 생성하기 위해 유리알이 함유된 음식을 준비한다. 이산화탄소 마취 후, 페인트 브러시를 사용하여 돌연변이 라인의 수컷 5마리와 스테르흉 막힌 엽의 처녀 암컷 10마리를 유리알에 고정하여 십자가를 만듭니다.
바이알을 섭씨 25도에 놓습니다. 10 일에서 12 일 후에, 돌연변이된 염색체 및 마커 염색체를 들고 적어도 15개의 처녀 암컷 자손을 수집합니다. 스커로이드 또는 동등한 위에 또 다른 눈에 띄는 지배적 인 마커 컬리 O를 운반 균형 잡힌 라인에서 다섯 남성으로 교차.
10~12일 후에, 스큐로이드 또는 컬리 O를 운반하는 이종수 수컷 자손과 십자가에서 잠재적으로 재결합된 염색체를 수집하십시오. 개별적으로 돌연변이 염색체를 들고 주식에서 처녀 여성에 그들을 짝짓기. 10일에서 12일 후, 마지막 십자가에서 바이알을 함유한 새로운 음식으로 자손과 10~14일 의 섭씨 29도에서 10~14일간 날아간다.
플라이 헤드에 히스토로지를 수행하고 각 개별 십자가의 자손을 위해 반복합니다. 이 정보를 사용하여, 열성 돌연변이의 위치를 정제하기 위하여 염색체의 좁은 지역에 결핍 매핑을 능력을 발휘합니다. 각 결핍 라인은 보완 테스트에 사용할 수 있도록 염색체의 다른 영역의 삭제가 있습니다.
다음으로, 두 번째 염색체에 대한 Drosophila 결핍 키트에서 크로스 라인과 관심의 표현형의 비 보완을 찾습니다. DNA 서열 분석에 대한 참조를 얻으려면, FlyBase로부터 BRAT 유전자의 게놈 합의 서열을 포함하는 FASTA 포맷 파일을 다운로드하거나 유전 적 배경 제어의 BRAT 서열에 대한 결과를 포함하는 파일을 사용, 예를 들어 원래 돌연변이 드로소필라 라인. Plasmid 편집기에서 시퀀싱 파일을 엽니다.
편집으로 이동하여 정렬 시퀀스를 클릭합니다. 컴퓨터의 마우스를 사용하여 비교할 모든 시퀀스를 선택합니다. 드롭 메뉴에서 이 정렬에 대한 참조 순서를 나타냅니다.
기준 서열과 비교하여 뉴클레오티드 변화를 위해 서열된 영역을 검사한다. 원하는 경우 텍스트를 클릭하여 RTF 형식으로 컴퓨터에 정렬을 저장한 다음 저장합니다. 각 십자가에서 F1 자손을 수집하여 구조 실험을 수행합니다.
표시된 밸러운더를 신중하게 선택합니다. 나이 Drosophila 음식 매체에 파리 29 섭씨 및 이전과 같은 신경 변성을 찾기 위해 뇌에 대한 히스토로지 분석을 수행. 867 돌연변이체에서 신경 변성의 연령 의존분석을 수행하기 위해, 5, 15 및 25 일까지 비행하고 후속 히스토로지 분석을 수행합니다.
이 프로토콜은 등반 분석을 사용하여 화학적으로 돌연변이 된 파리의 컬렉션을 통해 화면하는 앞으로 유전적 접근법을 제시합니다. 235개의 호모자구선 중, 테스트된 라인의 약 37%가 10~12일의 나이에 테스트할 때 50% 미만의 등반 패스 율을 보였습니다. 51개의 후속 조직학적 화면에서 가장 낮은 등반 패스 속도를 나타내는 29개의 대사가 경증에서 중증 신경변성까지 뇌 신경필에 구멍이 눈에 띄는 모습을 보였다는 사실이 밝혀졌습니다.
867 파리의 신경 변성 표현형은 야생 형 균주에 교차 된 이종구스 867 파리의 뇌가 대조군과 비교할 수 있었기 때문에 열성입니다. 결핍 라인 Df24116은 등반 분석에 기초한 867 돌연변이 표현형을 보완하지 않습니다. 조직학적 검증은 Df24116이 867신경변성 표현형을 보완하지 않는 반면 Df9296은 결핍라인을 나타낸다.
867 돌연변이체의 뇌 표현형을 살펴보면 추가 결핍 선으로 넘어갔으며, 이는 돌연변이가 유전자 BRAT를 포함하는 게놈 의 영역에 포함되어 있음을 확인하였다. 이 프로토콜이 부적절하게 실행되면 후보 유전자의 신경 변성과 돌연변이의 식별에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 단계를 결합으로이 절차 동안 엄격하고 정확하게 작동하는 것이 중요합니다. 확인된 유전자에 따라, 후속 분석은 신경 변성의 알려진 통로에서 역할을 하는 유전자와의 관심 또는 상호 작용의 유전자의 추가 난소 시험을 포함할 수 있습니다.
공장 학적 절차 동안, 그것은 클로로폼을 포함 하기 때문에 주의 하 여 Carnoy의 고정 솔루션을 처리 하는 것을 기억 하십시오. 장갑을 착용하고 연기 후드 아래에 이상적인 적절한 환기와 함께 사용하십시오. 마찬가지로, 연기 후드 아래에 얼룩진 모든 히스토로지를 수행합니다.
