Основная цель этого протокола заключается в использовании силы вперед генетики для выявления генов, которые, когда дисрегулируется привести к нейродегенерации. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает беспристрастный и простой подход к выявлению нейропротекторных генов, которые могут быть более трудными для выполнения в моделях млекопитающих. Этот метод может быть использован для выявления новых генов, участвующих в процессе нейродегенерации, которая связана со многими заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.
В дополнение к выявлению нейропротекторных генов, форвардный генетический подход может быть использован для обнаружения генов, участвующих в других биологических процессах, таких как функции нейронов и передачи. Для начала соберите однородных мух с линий, принадлежащих к мутагенизированной коллекции мутантов Дрозофилы, отображенных на вторую хромосому. Переверните мух в возрасте от 10 до 12 дней в тестовую камеру без анестезии по одной линии за раз и дайте им восстановиться в течение пяти минут.
С пятиметровой линии знака вниз, насильственно нажмите камеру три раза на коврик для мыши размещены на твердой поверхности, так что все мухи начинают анализ в нижней части. Наблюдайте за передвижением в течение 10 секунд. Замехать количество мух, которые достигают или проходят пятиметровую линию в течение этого времени, а также общее количество проверенных мух.
Подождите одну минуту, прежде чем начать второе судебное разбирательство. Повторите минимум три пробных репликации на строку. После обезболивания мух на площадку двуокиси углерода, разорвать летать головы с хирургическим лезвием и использовать кисть, чтобы аккуратно поместить их в один миллилитр фиксатора Карноя в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки.
Затем храните трубку при четырех градусах по Цельсию на ночь. На следующий день убедитесь, что головки погружены в фиксаторный раствор. Под капотом дыма используйте пипетку P1000, чтобы заменить фиксаторный раствор одним миллилитром 70%этанола и поддерживать образцы при четырех градусах Цельсия для будущего анализа.
Используя пипетки Pasteur, перенесите фиксированные головки в микробиопсии кассеты и закрыть кассеты. Отправьте кассеты в гистологическое учреждение для обработки или поместите их в автоматизированную машину обработки тканей, если таковые имеются на месте. Запустите программу, чтобы обезвоживать, очистить и проникнуть в головы с парафином.
Затем перенесите кассеты в парафин встраивания станции с парафином нагревается при 60 градусов по Цельсию и место металлических форм базы, которые соответствуют кассеты на нагретой станции. Используйте тонкие типсы, чтобы сориентировать головы так, чтобы они сталкиваются сверху в базовой форме. Правильная ориентация головы имеет решающее значение для гистологического анализа.
После затвердевания обрежьте каждый парафиновый блок, чтобы свести к минимуму поверхность, которая будет секционой. Вырезать пять микрометровых секций каждого блока на микротоме. Затем поместите секционые парафиновые ленты в нагретую водяную баню при 35 градусах По Цельсию максимум на пять минут.
Погрузите горку с полилиновым покрытием в нагретую водяную баню и используйте деревянный аппликатор, чтобы разместить секционые ленты на слайде. Пусть слайды воздух сухой на ночь при комнатной температуре. На следующий день используйте слайд теплее, чтобы нагреть горки в течение 15 минут при температуре 63 градусов по Цельсию.
Под капотом дыма, поместите слайды на стойку окрашивания слайда и поместите стойку в HistoChoice в течение пяти минут дважды с последующим несколько этанола и дистиллированной обработки водяной ванны в соответствии с рукописью. Перенесите стойку в контейнер, заполненный Харрисом Гематоксилином, на две-пять минут, чтобы испачкать. Затем возьмите стойку из раствора гематоксилина и поместите его под проточной водопроводной водой в течение 10 минут до следующих шагов окрашивания.
После окрашивания, используя типсы, возьмите слайды из раствора HistoChoice или Xylene. Опустите тонкий слой постоянной монтажной среды на образец и аккуратно поместите крышку сверху. Избегайте образования пузырьков.
После того, как монтажная среда затвердевает, поместите слайд под световой микроскоп, чтобы получить изображения репрезентативных секций мозга примерно в середине мозга. Во-первых, подготовить пищу, содержащую флакон для генерации гетерозиготных самок мух. После анестезии двуокиси углерода, используйте кисть для передачи пяти самцов мутантной линии и 10 девственных самок стерноплеуральной застрявшей доли и булавки над линией Curly O во флакон, чтобы сделать крест.
Поместите флакон при 25 градусах по Цельсию. Через 10-12 дней соберите по крайней мере 15 девственниц женского потомства, несущих мутировавшие хромосомы и маркер хромосомы. Пересеките их до пяти самцов из сбалансированной линии, которая несет в себе еще один видимый доминирующий маркер Curly O над скутоидом или эквивалентом.
Через 10-12 дней соберите гетерозиготное мужское потомство, несущее либо скутоид или curly O, либо потенциально рекомбинированную хромосому от креста. Индивидуально спаривайте их с девственными самками из бульона, несущими мутировавшие хромосомы. 10 до 12 дней более поздно, собирают потомство от последнего креста в новую еду содержа флаконы и стареют мухи на 29 градусах Celsius до от 10 до 14 дней.
Выполните гистологию на лету головы и повторить для потомства каждого отдельного креста. С помощью этой информации выполните отображение дефицита на суженной области хромосомы, чтобы уточнить расположение рецессивной мутации. Каждая линия дефицита имеет удаление различных области хромосом, что позволяет использовать их для тестирования на дополнение.
Далее, поперечные линии от набора дефицита дрозофилы для второй хромосомы и искать не дополнять фенотип интереса. Чтобы получить ссылку на анализ последовательности ДНК, загрузите файл формата FASTA, содержащий геномную консенсусную последовательность гена BRAT от FlyBase, или используйте файл, содержащий результаты для последовательности BRAT генетического фонового контроля, например первоначально мутагенизированную линию Drosophila. Открытые файлы секвенирования в редакторе A Plasmid.
Перейти к редактировать и нажмите выравнивание последовательностей. Используя мышь компьютера, выберите все последовательности для сравнения. В меню капли укажите последовательность ссылок для этого выравнивания.
Проинспектировать секвенированную область на нуклеотидные изменения по сравнению с эталонной последовательностью. При желании сохраните выравнивание на компьютере в формате RTF, нажав на текст, а затем сохраните. Выполните спасательный эксперимент, собирая потомство F1 с каждого креста.
Тщательно выберите от отмеченных балансеров. Возраст мух на Drosophila пищевой среды на 29 градусов по Цельсию и выполнять гистологический анализ на мозг, чтобы искать нейродегенерации, как и раньше. Для выполнения возрастного анализа нейродегенерации у 867 мутантов возраст мух составляет пять, 15 и 25 дней и проводится последующий гистологический анализ.
Этот протокол представляет собой перспективный генетический подход к экрану через коллекцию химически мутагенизированных мух с помощью альпинистского анализа. Среди 235 однородных линий около 37% проверенных линий продемонстрировали скорость восхождения ниже 50% при тестировании в возрасте от 10 до 12 дней. Последующий гистологический экран на 51 из линий, свидетельствуюющих о самой низкой скорости восхождения, показал, что 29 из этих линий показали видимый вид отверстий в нейропиле мозга от легкой до тяжелой, указывая на нейродегенерацию.
Фенотип нейродегенерации у 867 мух рецессивный, потому что мозг гетерозиготных 867 мух, которые были перечеркнули с диким штаммом типа были сопоставимы с теми из элементов управления. Линия дефицита Df24116 не дополняет фенотип мутантов 867 на основе альпинистского анализа. Гистологическая проверка показывает, что линия дефицита Df24116 не дополняет фенотип нейродегенерации 867, в то время как Df9296 делает.
Изучение фенотипа мозга 867 мутантов перешло к дополнительным линиям дефицита подтвердил, что мутация содержится в области генома, который включает в себя ген BRAT. Важно помнить, что во время этой процедуры работать как можно более строго и точно, так как этот протокол сочетает в себе несколько этапов, которые при неправильном выполнении могут повлиять на идентификацию мутантов с нейродегенерацией в генах-кандидатах. В зависимости от выявленных генов, последующий анализ может включать тестирование дополнительных овул генов интереса или взаимодействия с генами, которые играют роль в известных путях нейродегенерации.
Во время гистологии процедуры, не забудьте справиться с фиксаторным раствором Carnoy с осторожностью, поскольку он содержит хлороформ. Носите перчатки и использовать с адекватной вентиляции идеально под капотом дыма. Аналогичным образом, выполнять все гистологии окрашивания под капотом дыма.
