L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di utilizzare il potere della genetica in avanti per identificare i geni che quando disregolati portano alla neurodegenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un approccio imparziale e diretto per l'identificazione di geni neuroprotettivi che potrebbero essere più difficili da eseguire nei modelli di mammiferi. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare nuovi geni implicati nel processo di neurodegenerazione che è associato a molte condizioni di malattia come l'Alzheimer e il morbo di Parkinson.
Oltre a identificare i geni neuroprotettivi, l'approccio genetico in avanti può essere utilizzato per scoprire geni coinvolti in altri processi biologici come la funzione neuronale e la trasmissione. Per iniziare, raccogliere mosche omozigote da linee appartenenti alla collezione mutagenizzata ENU di mutanti Drosophila mappati al secondo cromosoma. Capovolgere le mosche di età compresa tra 10 e 12 giorni in una camera di prova senza anestesia una linea alla volta e consentire loro di recuperare per cinque minuti.
Con la linea di cinque centimetri che segna il lato verso il basso, toccare forzatamente la camera tre volte su un tappetino del mouse posizionato su una superficie solida in modo che tutte le mosche inizino il saggio nella parte inferiore. Osserva la locomozione della mosca per un periodo di 10 secondi. Registra il numero di mosche che raggiungono o superano la linea dei cinque centimetri entro questo periodo, nonché il numero totale di mosche testate.
Attendere un minuto prima di iniziare una seconda prova. Ripetere almeno tre repliche di prova per riga. Dopo aver anestetizzato le mosche su un tampone di anidride carbonica, premere teste di mosca con una lama chirurgica e utilizzare un pennello per posizionarle delicatamente in un millilitro del fissatore di Carnoy in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Quindi conservare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, assicurarsi che le teste siano affondate nella soluzione fissante. Sotto una cappa aspirante, utilizzare una pipetta P1000 per sostituire la soluzione fissante con un millilitro di etanolo al 70% e mantenere i campioni a quattro gradi Celsius per analisi future.
Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire le testine fisse in cassette microbiopsia e chiudere le cassette. Inviare le cassette a una struttura istologia per la lavorazione o posizionarle in una macchina automatizzata per la lavorazione dei tessuti, se disponibile in loco. Esegui il programma per disidratare, cancellare e infiltrarsi nelle teste con la paraffina.
Quindi trasferire le cassette in una stazione di incorporamento di paraffina con paraffina riscaldata a 60 gradi Celsius e posizionare stampi di base metallici che si adattano alle cassette sulla stazione riscaldata. Utilizzare forcep fini per orientare le teste in modo che si affacciano sulla parte superiore dello stampo di base. Un corretto orientamento della testa è fondamentale per l'analisi istologico.
Dopo l'indurimento, tagliare ogni blocco di paraffina per ridurre al minimo la superficie che verrà sesata. Tagliare cinque sezioni di micrometro di ogni blocco sul microtomo. Quindi, posizionare i nastri di paraffina sesati in un bagno d'acqua riscaldato a 35 gradi Celsius per un massimo di cinque minuti.
Immergere uno scivolo rivestito di polilisina nel bagno d'acqua riscaldato e utilizzare un applicatore in legno per posizionare i nastri sezionati sullo scivolo. Lasciare asciugare l'aria degli scivoli durante la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, utilizzare uno scaldascivole per riscaldare le diapositive per 15 minuti a 63 gradi Celsius.
Sotto una cappa aspirante, posizionare gli scivoli su un rack di colorazione scorrevole e posizionare il rack in HistoChoice per cinque minuti due volte seguito da diversi trattamenti di etanolo e bagno d'acqua distillati secondo il manoscritto. Trasferire il rack in un contenitore pieno di Hematoxylin Harris per due o cinque minuti per macchiare. Quindi estraere il rack dalla soluzione di ematossilina e posizionarlo sotto l'acqua corrente del rubinetto per 10 minuti prima dei seguenti passaggi di colorazione.
Dopo la colorazione, utilizzando le forcep, eseguire le diapositive dalla soluzione HistoChoice o Xylene. Gocciolare un sottile strato di mezzo di montaggio permanente sul campione e posizionare delicatamente un coverslip sulla parte superiore. Evitare la formazione di bolle.
Dopo che il mezzo di montaggio è stato indurito, posizionare lo scivolo al microscopio leggero per ottenere immagini di sezioni cerebrali rappresentative a circa il midbrain. In primo luogo, preparare un alimento contenente fiala per generare mosche femminili eterozigoti. Dopo l'anestesia di anidride carbonica, usa un pennello per trasferire cinque maschi della linea mutante e 10 femmine vergini del lobo sternopleurale inceppato e pin sulla linea Curly O nel flaconcino per fare una croce.
Posizionare il flaconcino a 25 gradi Celsius. Dopo 10-12 giorni, raccogliere almeno 15 progenie femminile vergine che trasporta il cromosoma mutato e il cromosoma marcatore. Attraversali a cinque maschi da una linea equilibrata che porta un altro marcatore dominante visibile Curly O su scutoide o equivalente.
Dopo 10-12 giorni, raccogliere la progenie maschile eterozigote che trasporta scutoide o Riccio O e il cromosoma potenzialmente ricombinato dalla croce. Accoppiali individualmente alle femmine vergini dello stock che trasportano il cromosoma mutato. Da dieci a 12 giorni dopo, raccogli la progenie dall'ultima croce in nuovo cibo contenente fiale e invecchia le mosche a 29 gradi Celsius a 10-14 giorni.
Esegui l'istologia sulle teste di mosca e ripeti per la progenie di ogni singola croce. Con queste informazioni, eseguire la mappatura della carenza sulla regione ristretta del cromosoma per perfezionare la posizione della mutazione recessiva. Ogni linea di carenza ha una cancellazione di diverse regioni dei cromosomi permettendo loro di essere utilizzate per i test di completamento.
Successivamente, le linee trasversali dal kit di carenza di Drosophila per il secondo cromosoma e cercano la non complementazione del fenotipo dell'interesse. Per ottenere un riferimento per l'analisi della sequenza del DNA, scaricare un file in formato FASTA contenente la sequenza di consenso genomico del gene BRAT da FlyBase o utilizzare un file contenente i risultati per la sequenza BRAT di un controllo genetico dello sfondo, ad esempio la linea Drosophila originariamente mutagenizzata. Aprire i file di sequenziamento nell'editor plasmide A.
Passare a Modifica e fare clic su Allinea sequenze. Utilizzando il mouse del computer, selezionare tutte le sequenze da confrontare. Nel menu a discesa indicare la sequenza di riferimento per questo allineamento.
Ispezionare la regione sequenziata alla ricerca di cambiamenti nucleotidici rispetto alla sequenza di riferimento. Se lo si desidera, salvare l'allineamento su un computer in formato RTF facendo clic su Testo e quindi su Salva. Esegui l'esperimento di salvataggio raccogliendo la progenie di F1 da ogni croce.
Selezionare con cura i bilanciatori contrassegnati. Invecchia le mosche sul mezzo alimentare Drosophila a 29 gradi Celsius ed esegui analisi istologico sul cervello per cercare la neurodegenerazione come in precedenza. Per eseguire analisi di neurodegenerazione dipendenti dall'età in 867 mutanti, invecchiare le mosche a cinque, 15 e 25 giorni ed eseguire successive analisi istomiche.
Questo protocollo presenta un approccio genetico in avanti allo schermo attraverso una collezione di mosche chimicamente mutagene usando un saggio di arrampicata. Tra le 235 linee omozigote, circa il 37% delle linee testate presentava una velocità di passaggio di arrampicata inferiore al 50% se testata all'età di 10-12 giorni. Il successivo schermo istologico su 51 delle linee che mostrano il più basso tasso di passaggio di arrampicata ha rivelato che 29 di queste linee hanno mostrato un aspetto visibile di buchi nel neuropilo cerebrale che vanno da lievi a gravi indicativi di neurodegenerazione.
Il fenotipo di neurodegenerazione in 867 mosche è recessivo perché il cervello delle mosche eterozigoti 867 che sono state superate a un ceppo di tipo selvaggio erano paragonabili a quelle dei controlli. La linea di carenza Df24116 non completa il fenotipo mutante 867 basato sul saggio di arrampicata. La verifica istologica mostra che la linea di carenza Df24116 non completa il fenotipo di neurodegenerazione 867 mentre Df9296 lo fa.
Esaminando il fenotipo cerebrale di 867 mutanti incrociati con ulteriori linee di carenza ha confermato che la mutazione è contenuta nella regione del genoma che include il gene BRAT. È importante ricordare durante questa procedura di lavorare nel modo più rigoroso e preciso possibile in quanto questo protocollo combina diversi passaggi che se eseguiti in modo improprio possono influenzare l'identificazione dei mutanti con la neurodegenerazione nei geni candidati. A seconda dei geni identificati, l'analisi successiva può includere il test di ovuli aggiuntivi del gene di interesse o interazioni con geni che svolgono un ruolo in percorsi noti di neurodegenerazione.
Durante la procedura istologico, ricorda di gestire la soluzione fissante del Carnoy con cautela poiché contiene cloroformio. Indossare guanti e utilizzare con un'adeguata ventilazione idealmente sotto il cofano dei fumi. Allo stesso modo, eseguire tutta la colorazione istologia sotto la cappa dei fumi.
