このプロトコルの主な目標は、不安定化が神経変性につながる遺伝子を同定するために、フォワード遺伝学の力を利用することです。この技術の主な利点は、哺乳類モデルで実行することがより困難である可能性のある神経保護遺伝子の同定のための公平で簡単なアプローチを提供することです。この技術は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの多くの疾患状態に関連する神経変性の過程に関与する新しい遺伝子を同定するために使用することができる。
神経保護遺伝子の同定に加えて、前方遺伝的アプローチは、神経機能および伝達などの他の生物学的プロセスに関与する遺伝子を発見するために使用することができる。まず、第2染色体にマッピングされたショウジョウバエ変異体のENU変異体化コレクションに属する線からホモ接合ハエを収集する。10〜12日齢のハエを麻酔なしで試験室にひっくり返し、5分間回復することができます。
5センチメートルのラインマークを下にして、固体表面に置かれたマウスパッドの上にチャンバーを3回強制的にタップして、すべてのハエが下部でアッセイを開始します。10秒間、飛ぶ移動を観察します。この時間内に5センチメートル線に到達または通過するハエの数と、テストされたハエの総数を記録します。
1 分待ってから、2 回目のトライアルを開始します。1 行あたり最低 3 回の試行の反復を繰り返します。二酸化炭素パッドでハエを麻酔した後、外科用ブレードで頭を切断し、ペイントブラシを使用してカーノイの固定剤の1ミリリットルに優しく1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れます。
その後、一晩摂氏4度でチューブを保存します。翌日、固定溶液でヘッドが沈んでいるか確認してください。ヒュームフードの下で、P1000ピペットを使用して固定溶液を70%エタノールの1ミリリットルに置き換え、将来の分析のためにサンプルを摂氏4度に維持します。
パスツールピペットを使用して、固定ヘッドをマイクロバイオプシーカセットに移し、カセットを閉じます。カセットを組織学施設に送って処理したり、現場で利用可能な場合は自動組織処理機に入れます。プログラムを実行して、パラフィンで頭を脱水し、クリアし、浸透させます。
その後、60°Cで加熱されたパラフィンでパラフィン埋め込みステーションにカセットを移し、加熱されたステーションにカセットに収まる金属ベース金型を配置します。細かい鉗子を使用して、ヘッドの向きを基にして、ベースモールドの上部に向かうようします。正しい頭部の向きは、神学分析にとって重要です。
硬化後、各パラフィンブロックをトリミングして、切り離される表面を最小限に抑えます。マイクロトーム上の各ブロックの5マイクロメートルのセクションをカットします。次に、断切したパラフィンリボンを熱湯浴に35°Cで最大5分間置きます。
ポリリジンコーティングされたスライドを温水浴に浸し、木製のアプリケーターを使用して、切り離されたリボンをスライドに配置します。スライドの空気を室温で一晩乾燥させます。翌日、スライドウォーマーを使用して、スライドを摂氏63度で15分間加熱します。
ヒュームフードの下にスライドを置き、スライド染色ラックに置き、ヒストチョイスにラックを5分間2回置き、その後、原稿に従っていくつかのエタノールと蒸留水浴処理を行います。ラックをハリス・ヘマトキシリンで満たされた容器に2~5分間移して汚します。その後、ヘマトキシリン溶液からラックを取り出し、次の染色手順の前に10分間水道水の下に置きます。
鉗子を使用して染色した後、ヒストチョイスまたはキシレン溶液からスライドを取り出します。サンプルに永久取り付け媒体の薄い層を滴下し、上にカバースリップをそっと置きます。気泡の形成を避ける。
取り付け媒体が硬化した後、スライドを軽い顕微鏡の下に置き、およそ中脳で代表的な脳切片の画像を得る。まず、ヘテロ接ゴス雌ハエを発生させるバイアルを含む食品を準備する。二酸化炭素麻酔の後、ペイントブラシを使用して、突然変異線の5人の男性と、星膜詰まったローブの10人の処女女性を移送し、カーリーOラインを介し十字架を作ります。
バイアルを摂氏25度に置きます。10〜12日後、変異した染色体とマーカー染色体を運ぶ少なくとも15人の処女女性子孫を収集する。スカットイドまたは同等の上に別の可視支配的なマーカーカーリーOを運ぶバランスのとれたラインから5人の男性にそれらを渡ります。
10〜12日後、スキュトイドまたはカーリーOのいずれかを運ぶヘテロ接合性男性の子孫と、十字架から再結合する可能性のある染色体を収集します。変異した染色体を運ぶストックから処女女性にそれらを個別に合致させる。10〜12日後、バイアルを含む新しい食品に最後の十字架から子孫を収集し、10〜14日に摂氏29度でハエを老化させます。
フライヘッドで組織学を実行し、個々のクロスの子孫のために繰り返します。この情報により、染色体の狭い領域に対して欠乏性マッピングを行い、劣性突然変異の位置を微細化する。各欠乏線は、染色体の異なる領域の欠失を有し、それらを相補試験に使用することを可能にする。
次に、第2染色体のショウジョウバエ欠損キットからのクロスラインを、目的の表現型の非相補性を探す。DNA配列解析の参照を得るには、BraT遺伝子のゲノムコンセンサス配列を含むFASTAフォーマットファイルをFlyBaseからダウンロードするか、遺伝的背景制御のBRAT配列の結果を含むファイル(例えば、もともと変異型ショウジョウバエ線)を使用します。A プラスミド エディタでシーケンス ファイルを開きます。
[編集] に移動し、[シーケンスの整列] をクリックします。コンピュータのマウスを使用して、比較するすべてのシーケンスを選択します。ドロップ メニューで、この配置の参照順序を指定します。
配列配列領域に、参照配列と比較してヌクレオチド変化がないか調べる。必要に応じて、テキストをクリックして、RTF形式でコンピュータ上の配置を保存し、保存します。各十字架からF1子孫を集めて救助実験を行います。
マーク付きのバランサーを慎重に選択します。ショウジョウバエの食品培地でハエを摂氏29度で老化させ、脳の占頭分析を行い、以前のように神経変性を探す。867変異体における神経変性の年齢依存性分析を行うために、ハエを5、15、25日に老化させ、その後の占体分析を行う。
このプロトコルは、クライミングアッセイを使用して化学的に変異したハエのコレクションを通してスクリーニングするための前方遺伝的アプローチを提示する。235本のホモ接合線のうち、試験ラインの約37%が10〜12日の年齢で試験した場合、50%未満の上昇合格率を示した。最も低いクライミング合格率を示す51行の続く組織学的スクリーンは、これらのラインの29が軽度から重度の神経変性を示す脳神経剤の穴の目に見える外観を示すことを明らかにした。
867ハエの神経変性表現型は、野生型株に交差したヘテロ接合867ハエの脳がコントロールのものと同等であったため、劣性である。欠損線Df24116は、クライミングアッセイに基づく867変異表現型を補うものではありません。組織学的検証は、Df24116が867神経変性表現型を補完しない欠乏線を示すが、Df9296はそうする。
867変異体の脳表現型を調べて、追加の欠乏ラインに交差し、遺伝子BRATを含むゲノムの領域に突然変異が含まれていることが確認された。この手順の間に、このプロトコルは、不適切に実行された場合、候補遺伝子の神経変性と変異体の同定に影響を与えることができるいくつかのステップを組み合わせるので、可能な限り厳格かつ正確に動作することを覚えておくことが重要です。同定された遺伝子に応じて、その後の分析には、目的の遺伝子の追加の排卵の試験または神経変性の既知の経路において役割を果たす遺伝子との相互作用が含まれ得る。
体生の手順では、カルノイの固定液はクロロホルムが含まれているため、注意して処理してください。手袋を着用し、ヒュームフードの下で理想的に十分な換気で使用してください。同様に、ヒュームフードの下ですべてのヒストロジー染色を行います。
