L’objectif principal de ce protocole est d’utiliser la puissance de la génétique avancée pour identifier les gènes qui, lorsqu’ils sont dysregulated conduire à la neurodégénérescence. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une approche impartiale et directe pour l’identification des gènes neuroprotecteurs qui pourrait être plus difficile à effectuer dans les modèles mammifères. Cette technique peut être utilisée pour identifier de nouveaux gènes impliqués dans le processus de neurodégénérescence qui est associé à de nombreuses maladies telles que la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson.
En plus d’identifier les gènes neuroprotecteurs, l’approche génétique avancée peut être utilisée pour découvrir des gènes impliqués dans d’autres processus biologiques tels que la fonction neuronale et la transmission. Pour commencer, recueillir des mouches homozygotes à partir de lignées appartenant à la collection mutagenisée de mutants Drosophila de l’ENU cartographiées au deuxième chromosome. Retournez les mouches âgées de 10 à 12 jours dans une chambre d’essai sans anesthésie une ligne à la fois et laissez-leur récupérer pendant cinq minutes.
Avec le côté de marque de ligne de cinq centimètres vers le bas, appuyez de force sur la chambre trois fois sur un tapis de souris placé sur une surface solide de sorte que toutes les mouches commencent l’essai au fond. Observez la locomotion des mouches sur une période de 10 secondes. Enregistrez le nombre de mouches qui atteignent ou passent la ligne de cinq centimètres dans ce temps ainsi que le nombre total de mouches testées.
Attendez une minute avant de commencer un deuxième essai. Répétez un minimum de trois répétitions d’essai par ligne. Après avoir anesthésié les mouches sur un tampon de dioxyde de carbone, couper les têtes volantes avec une lame chirurgicale et utiliser un pinceau pour les placer doucement dans un millilitre de fixatif Carnoy dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Ensuite, conservez le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, assurez-vous que les têtes sont coulées dans la solution fixative. Sous un capot de fumée, utilisez une pipette P1000 pour remplacer la solution fixative par un millilitre de 70 % d’éthanol et maintenir les échantillons à quatre degrés Celsius pour une analyse future.
À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les têtes fixes dans des cassettes de microbiopsie et fermer les cassettes. Envoyez les cassettes à une installation d’histologie pour traitement ou placez-les dans une machine automatisée de traitement des tissus si elles sont disponibles sur place. Exécutez le programme pour déshydrater, dégager et infiltrer les têtes avec de la paraffine.
Ensuite, transférez les cassettes dans une station d’intégration de paraffine avec de la paraffine chauffée à 60 degrés Celsius et placez des moules de base en métal qui s’adaptent aux cassettes sur la station chauffée. Utilisez des forceps fins pour orienter les têtes de telle sorte qu’ils font face au dessus dans le moule de base. Une bonne orientation de la tête est essentielle pour l’analyse histologique.
Après durcissement, couper chaque bloc de paraffine pour minimiser la surface qui sera sectionnée. Couper cinq sections de micromètres de chaque bloc sur le microtome. Ensuite, placez les rubans de paraffine sectionné dans un bain d’eau chauffée à 35 degrés Celsius pendant un maximum de cinq minutes.
Immergez une glissade recouverte de polylysine dans le bain d’eau chauffée et utilisez un applicateur en bois pour placer les rubans sectionnés sur la toboggan. Laissez sécher l’air pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, utilisez un chauffe-glissière pour chauffer les toboggans pendant 15 minutes à 63 degrés Celsius.
Sous un capot de fumée, placez les glissières sur un support de coloration de glissière et placez le support dans HistoChoice pendant cinq minutes deux fois suivi de plusieurs traitements d’éthanol et de bain d’eau distillée selon le manuscrit. Transférer la grille dans un récipient rempli de Harris Hematoxylin pendant deux à cinq minutes pour tacher. Ensuite, sortez le support de la solution Hématoxyline et placez-le sous l’eau courante du robinet pendant 10 minutes avant les étapes suivantes de coloration.
Après coloration, à l’aide de forceps, sortez les diapositives de la solution HistoChoice ou Xylene. Égouttez une fine couche de milieu de montage permanent sur l’échantillon et placez doucement un coverslip sur le dessus. Évitez la formation de bulles.
Une fois le milieu de montage durci, placez la lame sous un microscope léger pour obtenir des images de sections cérébrales représentatives à environ midbrain. Tout d’abord, préparer un aliment contenant du flacon pour générer des mouches femelles hétérozygotes. Après anesthésie au dioxyde de carbone, utilisez un pinceau pour transférer cinq mâles de la lignée mutante et 10 femelles vierges du lobe coincé sternopleural et épingler au-dessus de la ligne Curly O dans le flacon pour faire une croix.
Placez le flacon à 25 degrés Celsius. Après 10 à 12 jours, recueillir au moins 15 descendance féminine vierge portant le chromosome muté et le chromosome marqueur. Croisez-les à cinq mâles à partir d’une ligne équilibrée qui porte un autre marqueur dominant visible Curly O sur scutoïde ou équivalent.
Après 10 à 12 jours, recueillir la descendance masculine hétérozygote portant soit scutoïde ou Curly O et le chromosome potentiellement recombiné de la croix. Individuellement les accoupler à des femelles vierges du stock portant le chromosome muté. Dix à 12 jours plus tard, recueillir la descendance de la dernière croix dans de nouveaux aliments contenant des flacons et vieillir les mouches à 29 degrés Celsius à 10 à 14 jours.
Effectuez l’histologie sur des têtes de mouche et répétez pour la progéniture de chaque croix individuelle. Avec cette information, effectuer la cartographie des carences sur la région rétrécie du chromosome pour affiner l’emplacement de la mutation récessive. Chaque ligne de carence a une suppression de la région différente des chromosomes leur permettant d’être utilisés pour les tests de complémentarité.
Ensuite, croisez les lignes de la trousse d’insuffisance de Drosophila pour le deuxième chromosome et recherchez la non-complémentarisation du phénotype de l’intérêt. Pour obtenir une référence pour l’analyse des séquences d’ADN, téléchargez un fichier format FASTA contenant la séquence de consensus génomique du gène BRAT de FlyBase ou utilisez un fichier contenant des résultats pour la séquence BRAT d’un contrôle génétique de fond, par exemple la lignée Drosophila mutagenisée à l’origine. Ouvrez les fichiers de séquençage dans l’éditeur A Plasmid.
Allez modifier et cliquez sur Aligner les séquences. À l’aide de la souris de l’ordinateur, sélectionnez toutes les séquences à comparer. Dans le menu drop, indiquez la séquence de référence pour cet alignement.
Inspecter la région séquencée à la recherche de changements de nucléotide par rapport à la séquence de référence. Si vous le souhaitez, enregistrez l’alignement sur un ordinateur au format RTF en cliquant sur Texte puis Enregistrez. Effectuez l’expérience de sauvetage en recueillant la progéniture F1 de chaque croix.
Sélectionnez soigneusement les équilibreurs marqués. Vieillir les mouches sur le milieu alimentaire Drosophila à 29 degrés Celsius et effectuer une analyse histologique sur le cerveau à la recherche de neurodégénérescence comme précédemment. Pour effectuer l’analyse dépendante de l’âge de la neurodégénérescence chez 867 mutants, l’âge des mouches à cinq, 15 et 25 jours et effectuer une analyse histologique ultérieure.
Ce protocole présente une approche génétique avant de l’écran à travers une collection de mouches chimiquement mutagenisées à l’aide d’un essai d’escalade. Parmi les 235 lignées homozygotes, environ 37 % des lignées testées présentaient un taux de réussite en hausse inférieur à 50 % lorsqu’elles étaient testées à l’âge de 10 à 12 jours. L’écran histologique suivant sur 51 des lignes présentant le taux de passage d’escalade le plus bas a indiqué que 29 de ces lignes ont montré l’aspect visible des trous dans le neuropil de cerveau s’étendant de doux à grave indicatif de neurodégénérescence.
Le phénotype de neurodégénérescence chez 867 mouches est récessif parce que le cerveau des mouches hétérozygotes 867 qui ont été dépassées à une souche de type sauvage étaient comparables à ceux des témoins. La ligne de carence Df24116 ne complète pas le phénotype mutant 867 basé sur l’essai d’escalade. La vérification histologique montre que la ligne de carence Df24116 ne complète pas le phénotype de neurodégénérescence 867 alors que Df9296 le fait.
L’examen du phénotype cérébral de 867 mutants croisés à des lignées de carence supplémentaires a confirmé que la mutation est contenue dans la région du génome qui comprend le gène BRAT. Il est important de se rappeler au cours de cette procédure de travailler aussi rigoureusement et précisément que possible que ce protocole combine plusieurs étapes qui, si elles sont exécutées de manière incorrecte peut affecter l’identification des mutants avec la neurodégénérescence dans les gènes candidats. Selon les gènes identifiés, l’analyse ultérieure peut inclure l’essai d’ovules supplémentaires du gène de l’intérêt ou des interactions avec les gènes qui jouent un rôle dans les voies connues de neurodégénérescence.
Pendant la procédure d’histologie, n’oubliez pas de manipuler la solution fixative du Carnoy avec prudence car elle contient du chloroforme. Portez des gants et utilisez-les avec une ventilation adéquate idéalement sous le capot de fumée. De même, effectuer toutes les taches histologiques sous le capot de fumée.
