Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, die Macht der Vorwärtsgenetik zu nutzen, um Gene zu identifizieren, die, wenn dysreguliert, zu Neurodegeneration führen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen unvoreingenommenen und unkomplizierten Ansatz für die Identifizierung neuroprotektiver Gene bietet, die in Säugetiermodellen schwieriger durchzuführen sein könnten. Diese Technik kann verwendet werden, um neue Gene zu identifizieren, die in den Prozess der Neurodegeneration involviert sind, die mit vielen Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson verbunden ist.
Neben der Identifizierung neuroprotektiver Gene kann der vorwärtsgenetische Ansatz verwendet werden, um Gene zu entdecken, die an anderen biologischen Prozessen wie neuronaler Funktion und Übertragung beteiligt sind. Zu Beginn sammeln Sie homozygote Fliegen aus Linien, die zur enU mutagenisierten Sammlung von Drosophila-Mutanten gehören, die dem zweiten Chromosom zugeordnet sind. Drehen Sie die Fliegen im Alter von 10 bis 12 Tagen in eine Testkammer ohne Anästhesie eine Linie nach der anderen und lassen Sie sie für fünf Minuten erholen.
Tippen Sie mit der Fünf-Zentimeter-Linie auf der Seite nach unten dreimal auf ein Mauspad, das auf einer festen Oberfläche platziert ist, so dass alle Fliegen den Test unten beginnen. Beobachten Sie die Flugfortbewegung über einen Zeitraum von 10 Sekunden. Erfassen Sie die Anzahl der Fliegen, die die Fünf-Zentimeter-Linie innerhalb dieser Zeit erreichen oder passieren, sowie die Gesamtzahl der getesteten Fliegen.
Warten Sie eine Minute, bevor Sie eine zweite Testversion starten. Wiederholen Sie mindestens drei Testreplikationen pro Zeile. Nach der Anästhesisierung der Fliegen auf einem Kohlendioxid-Pad, fliegen Köpfe mit einer chirurgischen Klinge und verwenden Sie einen Pinsel, um sie sanft in einem Milliliter Von Carnoy fixativ in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu platzieren.
Dann lagern Sie die Röhre bei vier Grad Celsius über Nacht. Achten Sie am nächsten Tag darauf, dass die Köpfe in der Fixierlösung versenkt werden. Verwenden Sie unter einer Dunstabzugshaube eine P1000-Pipette, um die Fixierlösung durch einen Milliliter 70% Ethanol zu ersetzen und die Proben für die zukünftige Analyse bei vier Grad Celsius zu halten.
Mit einer Pasteur-Pipette die festinstallierten Köpfe in Mikrobiopsiekassetten übertragen und die Kassetten schließen. Senden Sie die Kassetten zur Verarbeitung an eine Histologieeinrichtung oder legen Sie sie in einer automatisierten Tissueverarbeitungsmaschine, sofern vor Ort verfügbar. Führen Sie das Programm aus, um die Köpfe mit Paraffin zu dehydrieren, zu löschen und zu infiltrieren.
Dann übertragen Sie die Kassetten in eine Paraffin-Einbettstation mit Paraffin, das bei 60 Grad Celsius erhitzt wird, und legen Sie Metallbasisformen, die zu den Kassetten passen, auf die beheizte Station. Verwenden Sie feine Zangen, um die Köpfe so auszurichten, dass sie der Oberseite in der Basisform gegenüberstehen. Die richtige Kopforientierung ist für die Histologieanalyse entscheidend.
Nach dem Härten schneiden Sie jeden Paraffinblock, um die zu schneidende Oberfläche zu minimieren. Schneiden Sie fünf Mikrometerabschnitte jedes Blocks auf dem Mikrotom. Als nächstes legen Sie die geschnittenen Paraffinbänder in einem beheizten Wasserbad bei 35 Grad Celsius für maximal fünf Minuten.
Tauchen Sie eine polylysinbeschichtete Rutsche in das beheizte Wasserbad ein und platzieren Sie die geschnittenen Bänder mit einem Holzapplikator auf der Rutsche. Lassen Sie die Rutschen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Am nächsten Tag, verwenden Sie eine Rutsche wärmer, um die Rutschen für 15 Minuten bei 63 Grad Celsius zu erwärmen.
Unter einer Dunstabzugshaube legen Sie die Dias auf eine Rutsche und legen Sie das Rack für fünf Minuten zweimal in HistoChoice, gefolgt von mehreren Ethanol- und destillierten Wasserbadbehandlungen nach dem Manuskript. Übertragen Sie das Rack für zwei bis fünf Minuten in einen mit Harris Hematoxylin gefüllten Behälter. Nehmen Sie dann das Rack aus der Hämatoxylin-Lösung und legen Sie es 10 Minuten unter fließendes Leitungswasser, bevor Sie die folgenden Färbeschritte durchführen.
Nach der Färbung, mit Zangen, nehmen Sie die Dias aus der HistoChoice oder Xylene Lösung. Eine dünne Schicht permanenten Montagemediums auf die Probe tropfen und vorsichtig einen Deckelschlupf auf die Oberseite legen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
Nachdem das Montagemedium gehärtet ist, legen Sie das Dia unter ein Lichtmikroskop, um Bilder von repräsentativen Hirnabschnitten bei etwa Midbrain zu erhalten. Zuerst bereiten Sie ein Lebensmittel mit Durchstechflasche für die Erzeugung heterozygoter weiblicher Fliegen zu. Nach der Kohlendioxid-Anästhesie, verwenden Sie einen Pinsel, um fünf Männchen der mutierten Linie und 10 jungfrauen Weibchen des sternopleuralen eingeklemmten Lappen zu übertragen und über Curly O Linie in die Durchstechflasche zu heften, um ein Kreuz zu machen.
Legen Sie die Durchstechflasche bei 25 Grad Celsius. Sammeln Sie nach 10 bis 12 Tagen mindestens 15 jungfräuliche weibliche Nachkommen, die das mutierte Chromosom und das Markerchromosom tragen. Überqueren Sie sie zu fünf Männchen aus einer ausgewogenen Linie, die eine andere sichtbare dominante Marker Curly O über Scutoid oder gleichwertig trägt.
Nach 10 bis 12 Tagen sammeln Sie die heterozygote männliche Nachkommenschaft, die entweder Scutoid oder Curly O und das potenziell rekombinierte Chromosom vom Kreuz trägt. Paaren Sie sie einzeln mit jungfräulichen Weibchen aus dem Bestand, der das mutierte Chromosom trägt. Zehn bis 12 Tage später, sammeln Sie die Nachkommen aus dem letzten Kreuz in neue Lebensmittel mit Fläschchen und altern die Fliegen bei 29 Grad Celsius bis 10 bis 14 Tage.
Führen Sie Histologie auf Fliegenköpfen und wiederholen für Nachkommen jedes einzelnen Kreuzes. Führen Sie mit diesen Informationen eine Mangelzuordnung auf einem verengten Bereich des Chromosoms durch, um die Position der rezessiven Mutation zu verfeinern. Jede Mangellinie hat eine Deletion verschiedener Regionen der Chromosomen, so dass sie für Komplementierungstests verwendet werden können.
Als nächstes kreuzen Sie Linien aus dem Drosophila-Mangelkit für das zweite Chromosom und suchen nach einer Nichtkomplementierung des Phänotyps des Interesses. Um eine Referenz für die DNA-Sequenzanalyse zu erhalten, laden Sie eine FASTA-Formatdatei mit der genomischen Konsenssequenz des BRAT-Gens aus FlyBase herunter oder verwenden Sie eine Datei mit Ergebnissen für die BRAT-Sequenz einer genetischen Hintergrundkontrolle, zum Beispiel die ursprünglich mutagenisierte Drosophila-Linie. Öffnen Sie Sequenzdateien im A Plasmid Editor.
Wechseln Sie zu Bearbeiten, und klicken Sie auf Sequenzen ausrichten. Wählen Sie mit der Maus des Computers alle zu vergleichenden Sequenzen aus. Geben Sie im Drop-Menü die Referenzsequenz für diese Ausrichtung an.
Überprüfen Sie den sequenzierten Bereich auf Nukleotidänderungen im Vergleich zur Referenzsequenz. Wenn gewünscht, speichern Sie die Ausrichtung auf einem Computer im RTF-Format, indem Sie auf Text und dann speichern klicken. Führen Sie das Rettungsexperiment durch, indem Sie F1-Nachkommen von jedem Kreuz sammeln.
Wählen Sie sorgfältig weg markierte Balancer. Altern Sie die Fliegen auf Drosophila Nahrungsmedium bei 29 Grad Celsius und führen Histologie-Analyse auf Gehirne, um für Neurodegeneration wie zuvor zu suchen. Um eine altersabhängige Analyse der Neurodegeneration bei 867 Mutanten durchzuführen, altern die Fliegen auf fünf, 15 und 25 Tage und führen anschließende histologische Analysen durch.
Dieses Protokoll stellt einen vorwärtsgenetischen Ansatz dar, um eine Ansammlung chemisch erbtagenisierter Fliegen mithilfe eines Kletterassays zu überprüfen. Von 235 homozygoten Linien wiesen etwa 37% der getesteten Linien eine Kletterpassrate unter 50% auf, wenn sie im Alter von 10 bis 12 Tagen getestet wurden. Nachfolgende histologische Darstellung auf 51 der Linien mit der niedrigsten Kletterpassrate zeigte, dass 29 dieser Linien sichtbares Aussehen von Löchern im Gehirn Neuropil von mild bis schwere Anzeichen für Neurodegeneration zeigten.
Der Neurodegeneration-Phänotyp bei 867 Fliegen ist rezessiv, da die Gehirne von heterozygoten 867 Fliegen, die zu einem wilden Stamm überkreuzt wurden, mit denen von Kontrollen vergleichbar waren. Die Mangellinie Df24116 ergänzt den 867 mutierten Phänotyp auf Basis des Klettertestes nicht. Die histologische Verifizierung zeigt, dass die Mangellinie Df24116 den Phänotyp 867 neurodegeneration nicht ergänzt, während Df9296 dies tut.
Die Untersuchung des Hirnphänotyps von 867 Mutanten, die zu zusätzlichen Mangellinien gekreuzt wurden, bestätigte, dass die Mutation in der Region des Genoms enthalten ist, die das Gen BRAT enthält. Es ist wichtig, sich während dieses Verfahrens daran zu erinnern, so streng und präzise wie möglich zu arbeiten, da dieses Protokoll mehrere Schritte kombiniert, die bei unsachgemäßer Ausführung die Identifizierung von Mutanten mit Neurodegeneration in Kandidatengenen beeinflussen können. Abhängig von den identifizierten Genen kann die nachfolgende Analyse das Testen zusätzlicher Proteine des Interesses oder Wechselwirkungen mit Genen umfassen, die eine Rolle in bekannten Pfaden der Neurodegeneration spielen.
Denken Sie während des Histologie-Verfahrens daran, die fixative Lösung des Carnoy mit Vorsicht zu behandeln, da sie Chloroform enthält. Tragen Sie Handschuhe und verwenden Sie mit ausreichender Belüftung ideal unter der Dunstabzugshaube. In ähnlicher Weise führen Sie alle Histologie Färbung unter der Rauchhaube.
