Bu protokolün temel amacı, disregulated nörodejenerasyona yol açan genleri tanımlamak için ileri genetiğin gücünü kullanmaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı, memeli modellerinde daha zor olabilecek nöroprotektif genlerin belirlenmesi için tarafsız ve basit bir yaklaşım sağlamasıdır. Bu teknik, Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi birçok hastalık koşulları ile ilişkili nörodejenerasyon sürecinde karıştığı yeni genleri tanımlamak için kullanılabilir.
Nöroprotektif genlerin tanımlanmasına ek olarak, ileri genetik yaklaşım nöronal fonksiyon ve iletim gibi diğer biyolojik süreçlerde yer alan genleri keşfetmek için kullanılabilir. Başlamak için, ikinci kromozom eşlenen Drosophila mutantların ENU mutajenize koleksiyonuna ait hatlardan homozigot sinektoplamak. 10-12 günlük sinekleri anestezi olmadan bir test odasına çevirin ve beş dakika boyunca iyileşmelerini bekleyin.
Beş santimetrelik çizgi işareti yan aşağı ile, zorla tüm sinekler alt tantifbaşlar, böylece katı bir yüzeye yerleştirilen bir fare altlığı üzerinde oda üç kez dokunun. 10 saniyelik bir süre içinde sinek hareket gözlemleyin. Bu süre içinde beş santimetrelik çizgiye ulaşan veya geçen sinek sayısını ve test edilen toplam sinek sayısını kaydedin.
İkinci bir duruşmaya başlamadan önce bir dakika bekleyin. Satır başına en az üç deneme çoğaltmasını yineleyin. Bir karbondioksit yastığı üzerinde sinek anestezi sonra, bir cerrahi bıçak ile sinek kafaları kesmek ve hafifçe 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp Içinde Carnoy fiksatif bir mililitre onları yerleştirmek için bir paintbrush kullanın.
Sonra tüpü bir gecede dört derecede saklayın. Ertesi gün, kafaları fiksatif çözüm battı emin olun. Bir duman kaputu altında, fiksatif çözeltiyi bir mililitre %70 etanol ile değiştirmek için p1000 pipetkullanın ve numuneleri gelecekteki analizler için dört santigrat derecede muhafaza edin.
Pasteur pipeti kullanarak, sabit kafaları mikrobiyopsi kasetlerine aktarın ve kasetleri kapatın. Kasetleri işleme için bir histoloji tesisine gönderin veya sahada varsa otomatik doku işleme makinesine yerleştirin. Programı susuz kalmak, parafinle kafaları temizlemek ve sızmak için çalıştırın.
Daha sonra kasetleri 60 derecede ısıtılan parafinle parafin gömme istasyonuna aktarın ve kasetleri ısıtmalı istasyona sığdıran metal taban kalıpları yerleştirin. Kafaları taban kalıbında üstle karşı karşıya gelecek şekilde yönlendirmek için ince periş kullanın. Doğru baş oryantasyonu histoloji analizi için çok önemlidir.
Sertleştikten sonra, kesilecek yüzeyi en aza indirmek için her parafin bloğunu kırpın. Mikrotomüzerinde her bloğun beş mikrometre sini kesin. Daha sonra, en fazla beş dakika boyunca 35 santigrat derecede ısıtılmış bir su banyosunda kesitli parafin şeritler yerleştirin.
Isıtmalı su banyosunda polilizin kaplı bir kaydırağı batırın ve kesitli şeritleri kaydırağa yerleştirmek için ahşap aplikatör kullanın. Slaytlar oda sıcaklığında bir gecede kuru masını bekleyin. Ertesi gün, slaytları 63 santigrat derecede 15 dakika ısıtmak için bir slayt ısıtıcıkullanın.
Bir duman kaputunun altında, slaytları bir slayt boyama rafına yerleştirin ve rafı beş dakika boyunca HistoChoice'a iki kez yerleştirin ve ardından el yazmasına göre birkaç etanol ve distile su banyosu tedavileri yapın. Rafı Harris Hematoxylin ile dolu bir kapta 2-5 dakika boyunca lekeleyin. Daha sonra rafı Hematoksilin çözeltisinden alın ve aşağıdaki boyama adımlarından önce 10 dakika boyunca akan musluk suyunun altına yerleştirin.
Forseps kullanarak boyama sonra, HistoChoice veya Xilene çözeltisi slaytlar almak. Numunenin üzerine ince bir kalıcı montaj ortamı katmanı damlatın ve üzerine hafifçe bir kapak kaydırın. Kabarcıklar oluşumunu önlemek.
Montaj ortamı sertleştikten sonra, yaklaşık orta beyin de temsili beyin bölümlerigörüntüleri elde etmek için bir ışık mikroskobu altında slayt yerleştirin. İlk olarak, heterozigot dişi sinekler üretmek için şişe içeren bir gıda hazırlamak. Karbondioksit anestezi sonra, mutant hattının beş erkek ve sternopleural sıkışmış lob 10 bakire kadın aktarmak için bir boya fırçası kullanın ve bir haç yapmak için şişe içine Kıvırcık O hattı üzerinde pin.
Şişeyi 25 santigrat dereceye yerleştirin. 10 ila 12 gün sonra, mutasyona uğramış kromozom ve marker kromozomtaşıyan en az 15 bakire kadın soyundan toplamak. Scutoid veya eşdeğer üzerinde başka bir görünür baskın marker Kıvırcık O taşıyan dengeli bir çizgiden beş erkek onları çapraz.
10 ila 12 gün sonra, ya scutoid veya Kıvırcık O ve çapraz potansiyel olarak yeniden kombine kromozom taşıyan heterozigot erkek soyundan toplamak. Mutasyona uğramış kromozomu taşıyan stoktan bakire dişilerle tek tek çiftleşin. On ila 12 gün sonra, şişeler içeren yeni gıda içine son çapraz gelen döl toplamak ve yaş 29 santigrat derece santigrat 10 ila 14 gün sinekler.
Sinek kafaları üzerinde histoloji gerçekleştirin ve her haç atası için tekrarlayın. Bu bilgilerle, resesif mutasyonun yerini hassaslaştırmak için kromozomun daralan bölgesinde eksiklik haritalama yapın. Her bir ekstansiyon hattı, kromozomların farklı bölgelerinin silinmesine ve tamamlayıcı lık testi için kullanılmasına olanak sağlar.
Daha sonra, ikinci kromozom için Drosophila eksikliği kiti çapraz çizgiler ve ilgi fenotip olmayan tamamlayıcı arayın. DNA dizianalizi için referans elde etmek için, FlyBase'den BRAT geninin genomik konsensüs dizisini içeren fasta formatında bir dosya indirin veya genetik arka plan kontrolünün BRAT dizisi için sonuçlar içeren bir dosya kullanın, örneğin başlangıçta mutajeize Drosophila hattı. Plazmid Düzenleyicisi'nde sıralama dosyalarını açın.
Düzenle'ye gidin ve Dizileri Hizala'yı tıklatın. Bilgisayarın faresini kullanarak karşılaştırmak için tüm dizileri seçin. Açılan menüde, bu hizalama için başvuru sırasını belirtin.
Referans sırasıyla karşılaştırıldığında nükleotid değişiklikleri için sıralı bölgeyi inceleyin. İstenirse, Metin'e tıklayarak hizalamayı RTF formatında bir bilgisayara kaydedin ve kaydedin. Her haç F1 dölleri toplayarak kurtarma deneyi gerçekleştirin.
İşaretli dengeleyicileri dikkatlice seçin. Yaş 29 santigrat derece Drosophila gıda orta sinekler ve daha önce olduğu gibi nörodejenerasyon aramak için beyin üzerinde histoloji analizi yapmak. 867 mutantta yaşa bağlı nörodejenerasyon analizini yapmak, sinekleri 5, 15 ve 25 güne yaşa getirmek ve sonraki histoloji analizini yapmak.
Bu protokol, tırmanma testi kullanarak kimyasal olarak mutajenize edilmiş sinekler koleksiyonu aracılığıyla ekrana ileri genetik bir yaklaşım sunar. 235 homozigot hat arasında, test edilen hatların yaklaşık %37'si 10-12 günlük kentest edildiğinde %50'nin altında bir tırmanma geçiş oranı sergilemiştir. En düşük tırmanma geçiş oranını sergileyen çizgilerin 51'inde daha sonraki histolojik tarama, bu çizgilerin 29'unun beyin nöropilinde hafiften şiddetli nörodejenerasyona kadar değişen deliklerin görünür bir görünümünü gösterdiğini ortaya koymuştur.
867 sinekteki nörodejenerasyon fenotipleri çekiniktir çünkü heterozigot 867 sineklerinin beyinleri yabani bir türe karşı çaprazlanmıştır. Eksiklik hattı Df24116 tırmanma testini temel alan 867 mutant fenotiptamamlamıyor. Histolojik doğrulama, Df24116 eksikliği çizgisinin 867 nörodejenerasyon fenotipini tamamlamadığını, Df9296 ise bunu gösterdiğini göstermektedir.
Ek eksiklik çizgilerine geçen 867 mutantın beyin fenotipinin incelenmesi, mutasyonun BRAT genini içeren genom bölgesinde bulunduğunu doğruladı. Bu protokol, yanlış yürütülürse aday genlerde nörodejenerasyon ile mutantların belirlenmesini etkileyebilir birkaç adım birleştirir gibi bu işlem sırasında mümkün olduğunca titiz ve kesin olarak çalışmak için hatırlamak önemlidir. Tanımlanan genlere bağlı olarak, sonraki analizler nörodejenerasyonun bilinen yollarında rol oynayan genlerle ilgi veya etkileşim geninin ek ovules test içerebilir.
Histoloji işlemi sırasında, kloroform içerdiğinden Carnoy'nin fiksatif çözeltisini dikkatli bir şekilde ele aldığıiçin unutmayın. Eldiven giyin ve duman kaputunun altında ideal olarak yeterli havalandırma ile kullanın. Benzer şekilde, duman başlık altında tüm histoloji boyama gerçekleştirin.
