Ce protocole est significatif parce qu’il permet à l’utilisateur de générer un système d’expression génomique qui peut subir d’autres épissages et dans ce cas former des ARN circulaires qui peuvent être testés pour leur fonction et l’association de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ouvrira la voie à d’autres pour utiliser ce protocole en biologie moléculaire et clonage lors de l’étude de l’épissage alternatif dans la formation et la fonction circulaires de l’ARN. Mon conseil à quelqu’un qui essaie cette technique pour la première fois serait d’optimiser les conditions PCR.
Exécutez des gradients ou exécutez pcr touchdown avec différentes températures d’annealing et temps d’extension. Habituellement, des fragments plus longs de plus de six KB prolongeront un KB par cycle et différentes températures d’annealage devraient être testées pour la meilleure amplification. La démonstration de cette méthode est essentielle car elle donnera aux utilisateurs une meilleure représentation visuelle des aspects les plus difficiles de la procédure, en particulier la génération d’amorce.
Pour commencer cette procédure, chargez le navigateur ucsc génome et l’utiliser pour identifier les éléments répétitifs nécessaires à la formation circulaire de l’ARN et les intégrer dans les constructions. Fait important, les amorces pour l’amplification doivent être en dehors des éléments répétitifs. Coller la séquence d’ARN circulaire dans la recherche blat humaine et sélectionnez le bon organisme.
Soumettez la séquence, rendez-vous à la vue du navigateur et effectuez un zoom arrière de 1,5 délai ou, le cas échéant. Ensuite, souris sur les éléments répétitifs pour identifier leur sous-type dans une fenêtre flottante. Les éléments Alu sont dans la ligne sinusoïde.
Utilisez le bouton de suivi par défaut sous la fenêtre pour réinitialiser le navigateur si une image incorrecte est obtenue. D’abord aller voir, l’ADN sur la ligne supérieure du navigateur génome USCS pour télécharger la séquence d’ADN montré dans la fenêtre. Dans l’option de mise en forme de séquençage, sélectionnez des options étendues cas/couleur.
Sélectionnez le cas par défaut comme cas inférieur et sélectionnez le boîtier de bascule pour NCBI RefSeq. Sélectionnez soulignez et gras et italique pour RepeatMasker. Cliquez sur soumettre.
Il y aura des exons comme majuscules et introns comme lettres minuscules. Vérifiez les bordures exon/intron. Si le navigateur affiche le complément inverse, retournez et sélectionnez la boîte de complément inversée jusqu’à ce que les bordures exon/intron correctes soient montrées.
Ensuite, copiez le fichier avec l’orientation correcte dans un document de traitement de texte et mettez en surbrillance les exons. Sélectionnez les fragments à amplifier en vous assurant que l’intron ne commence pas ou ne se termine pas dans une région répétitive, car les amorces de ces régions n’amplifieront pas des séquences spécifiques. Pour commencer, utilisez un outil Web pour concevoir les amorces pour le clonage.
Pour la séquence vectorielle, ajouter le site d’insertion comme dernier nucléotide et ajouter par la suite les fragments. Comme la numérotation vectorielle ne commence pas par un site d’insertion donné, le site d’insertion dans le vecteur est localisé et la partie aval est mise devant la séquence en amont. Ajustez les amorces si leurs points de fusion sont séparés de plus de quatre degrés Celsius et ne fonctionnent pas dans l’amplification.
Dans cette étude, les gènes des journalistes qui génèrent des ARN circulaires sont clonés et analysés. Les produits PCR optimisés sont séparés sur un gel d’agarose de 1% contenant 1X gel vert. Les bandes individuelles représentent les produits PCR qui seront utilisés dans l’assemblage d’ADN enzymatique.
Ces bandes sont ensuite découpées dans le gel et purifiées. Le produit PCR purifié ne fonctionne pas fidèle à la taille prévue avec gel vert de sorte que les produits sont également séparés sur un gel d’agarose de 1% qui est par la suite taché de bromure d’éthidium pour s’assurer que les produits sont de la bonne taille. Pour commencer, mettez en place un kit d’assemblage d’ADN enzymatique.
Combinez le vecteur et les inserts dans un rapport molaire de un à deux. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de mélange maître d’assemblage d’ADN. Incuber des échantillons pendant 60 minutes à 50 degrés.
Décongeler les cellules compétentes sur la glace pendant l’incubation. Les cellules doivent être dans un volume de 50 microlitres. Ensuite, transformez les cellules compétentes avec la réaction totale d’assemblage.
Ajouter deux microlitres du produit assemblé réfrigéré aux cellules compétentes. Mélanger en faisant glisser doucement le tube quatre à cinq fois. Ne pas vortex.
Déposer le mélange sur la glace pendant 30 minutes. La chaleur choque le mélange à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. Ensuite, placez-le sur la glace pendant deux minutes.
Après cela, ajouter 950 microlitres de température ambiante SOC médias au tube. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes tout en secouant à 300 RPM. Pendant cette incubation, réchauffer deux plaques de sélection qui contiennent l’antibiotique approprié.
Après l’incubation, centrifugez le tube de réaction à 10 000 g pendant 30 secondes pour pelleter les cellules et plaquer 25% des cellules sur une plaque de sélection et 75% sur l’autre. Incubez ces plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Avant de commencer la transfection, vérifiez votre ADN par restriction digest.
Ici, un minigène tau représentatif qui contient des exons neuf à 12 est coupé avec des enzymes de restriction indiquées pour exclure les recombinaisons majeures. Pour la transfection, dissoudre d’abord l’hydrochlorure linéaire de polyéthylène dans l’eau à une concentration d’un milligramme par millilitre au pH deux. Utilisez de l’hydroxyde de sodium pour amener le pH jusqu’à sept et filtrez stérilement la solution avec un filtre de 0,22 micromètre.
Conservez la solution à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Ensuite, divisez les cellules en puits d’une plaque de six puits et laissez-les pousser pendant la nuit à DMEM media contenant 10%FBS. Le lendemain, aliquot un microgramme du gène rapporté dans un tube stérile et ajouter 200 microlitres de chlorure de sodium filtré stérile de 150 millimlaires.
Mélanger par vortex. Ensuite, ajoutez la solution de polyéthyllènenimine à ce mélange à un rapport de trois microlitres de polyéthylnimine pour chacun microgramme d’ADN. Centrifugeuse brièvement pour recueillir des échantillons au fond du tube.
Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez-le directement aux cellules HEK293. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain, utilisez un kit d’isolation arn pour isoler l’ARN pour RT-PCR. cDNA de deux échantillons dérivés des tissus cérébraux humains sont amplifiés avec des amorces circulaires d’ARN circ tau exon 1210 inverse et circ tau exon 1211 vers l’avant. Bien que la bande attendue correspondant à l’ARN circulaire tau soit observée, les autres bandes fortes sont des artefacts qui ne correspondaient pas au génome humain.
Cette expérience est répétée avec des conditions PCR identiques, mais la transcription inverse n’a été effectuée qu’avec l’amorce inverse circ tau exon 1210. Seule la bande attendue est amplifiée et validée par séquençage. L’ARN est ensuite traité avec RNase R qui supprime l’ARN linéaire.
L’ARN circulaire est détectable après le traitement tandis que l’ARN linéaire ne donne plus de signal détectable. L’ARN est isolé 24 heures après transfection et analysé par RT-PCR. L’amplification de l’ARNm tau linéaire montre deux bandes dues à l’épissage alternatif de l’exon 10.
Leur rapport change à la sur-expression des facteurs d’épissage. L’amplification de l’ARN tau circulaire 1210 montre la dépendance de l’expression de l’ARN tau circ sur l’expression de certains facteurs d’épissage en particulier le Cdc2-like kinase CLK2 et la protéine SR 9G8. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est la conception et l’emplacement des amorces lors de la construction d’un minigène.
L’amorce ne doit pas se trouver dans des éléments répétitifs et devra être optimisée dans des conditions différentes selon le fragment amplifié. Après cette procédure, d’autres méthodes qui peuvent être effectuées seront de tester la fonction des ARN circulaires. Les utilisateurs peuvent tester la traduction ou la séquestration des protéines afin d’identifier une fonction pour l’ARN circulaire spécifique qui intéresse l’utilisateur.
Cette technique a ouvert la voie à l’utilisation de fragments génomiques dans un système minigène qui peut plus exprimer les ARN circulaires permettant à l’utilisateur de tester et d’identifier leur fonction et, dans certains aspects, leur association à la maladie. L’implication de cette technique s’étend aux thérapies potentielles et aux diagnostics d’une maladie particulière, par exemple tauopathies, maladies neurodégénératives liées à la pathologie tau. Nous avons découvert que la protéine tau associée aux microtubules, connue sous le nom de MAPT, génère des ARN circulaires qui, selon nous, contribuent à la pathologie de la maladie et cette méthode nous permet d’étudier pleinement ces ARN circulaires et d’identifier leur fonction et leur relation à la maladie.
Cette méthode pourrait donner un aperçu d’une meilleure compréhension des ARN circulaires, de leurs fonctions et du rôle qu’elles peuvent jouer dans certaines maladies. Cette méthode peut être appliquée dans le clonage d’autres minigènes qui expriment des ARN circulaires à travers les espèces où il peut fournir un aperçu de leur fonction. L’amplification des produits PCR s’avère être la plus difficile avec de longs fragments amplifiés à partir de l’ADN génomique, ainsi que d’avoir de multiples éléments répétitifs dans le fragment.
