המטרה הכוללת של מחקר זה היא לכייל ולבדוק מכשיר חדשני שניתן להשתמש בו למדידות in-situ של סמנים ביולוגיים בבתי גידול קריוספיריים. המכשיר מבוסס על טכנולוגיית פליטת פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי לייזר, המכונה LIFE. שיטות הדגימה הסטנדרטיות הנוכחיות מובילות להשפעות פיזיות על הדגימה עקב חציבה, התפוררות דגימות על ידי סתתים וניסות, והסטת טמפרטורה על ידי התכה.
שיטות אלה מובילות לעתים קרובות לזיוף של תנאים במקום. לכן, מתודולוגיה חדשה לגילוי ואפיון של חיים מיקרוביאליים היא קריטית. פיתחנו שיטה חדשנית לא פולשנית ולא הרסנית עם רזולוציה מרחבית ותכופת גבוהה.
היישום של טכניקת פליטת פלואורסצנטיות הנגרמת בלייזר מבוסס על העובדה כי סביבות על-גזעיות מיושבות, בין היתר, על ידי אורגניזמים פוטוטרופיים. אורגניזמים אלה יכולים להיות נעוצים בזיהוי של דפוסים פלואורסצנטיים של פיגמנטים אביזר מבוססי פורפירין כלורופיל A ופיקוריאטרין אשר נרגשים על ידי לייזר כחול וירוק בהתאמה. ערכת אורך הגל הכפול הניידת שוקלת 4.5 ק"ג ומשמשת על חצובה בשילוב עם מחשב חיצוני.
צינור העדשה מופנה לכיוון הדגימה. לאחר מכן, לייזר ירוק חמישה מילי וואט פוגע המדגם לאחר שעבר מפצל קרן קיטוב כי מפנה אור מקוטב לכיוון הציר האופטי של הספקטרומטר. הדגימה מציגה אור פלואורסצנטי המאויר באדום.
מחצית מהאור האיסוף עובר את מפצל הקרן המקוטב וממוקד באמצעות מסנן מעבר ארוך אשר מסיר את אותות הלייזר. לאחר מכן, האות פוגע בערך צמצם המורכב משני סכיני גילוח מתכווננים. מנסרה מפרידה ספקטרלית קו דק של אורתוגונל אור לצמצם הצמצם לפני שהאות נלכד בחיישן.
ההליך חוזר על עצמו עם הלייזר הכחול. הנתונים הגולמיים מועברים באופן אוטומטי למחשב נייד המשמש גם לפעולת התוכנה. הוא מחולק לשלושה חלקים עיקריים.
התאמת החשיפה נעשית באופן ידני. כאן, התיקון בין זמן החשיפה לעוצמת האות הוא ליניארי. שדה ההערה משמש לתיאור דוגמה.
במקטע הימני, תמונות גולמיות מוצגות מיד עם סיום המדידה. תכונה זו חיונית להערכת נתונים מיידית בשטח. אזורים אדומים מציינים פיקסלים עם חשיפת יתר שניתן להימנע מהם על ידי קיצור זמן החשיפה.
התמונות הגולמיות בגווני אפור של 12 סיביות מציגות רכיב מרחבי עקב חריץ הצמצם החד-ממדי ורכיב ספקטרלי עקב הפריזמה שלפני ה- CCD. בתגובה לאילוצים אופטיים, התמונות הגולמיות מעוותות. לכן, יש לחתוך אותם ולפסות אותם על-ידי החלת קוד המזהה את מידת העיוות.
לאחר מכן, כיול אורך הגל נעשה בעזרת לייזר 532 ננומטר. האור הירוק מופק על ידי הכפלת תדירות של לייזר אינפרא אדום 1, 064 ננומטר. שני אורכי הגל יכולים להיות מזוהים על ידי CCD ולכן המיקום הספקטרלי של כל פיקסל ניתן לחשב בתמונות dewarped.
לאחר מכן, התמונה נחתכת לטווח אורך גל נתון. ערכים אפורים מכל פיקסל בקו פיקסל שנבחר נספרים ומסוכמים. ערך אפור יכול לנוע בין אפס ל- 255.
לאחר מכן, כל שורת פיקסל מהווה מספר אחד. בגרף זה, הערך האפור סופר מכל קו פיקסלים מותווים כנגד הקואורדינטות המרחביות. זה מאפשר אפליה מרחבית כמותית של כלורופיל ופיקוריתרין בו זמנית בתוך המדגם.
בנוסף, ניתן להתוות את המאפיינים הספקטרליים של דגימה מקווי פיקסלים נבחרים. הגדרת השדה מהירה וקלה. חבר את הכלי על חצובה.
חבר את צינור העדשה למכשיר. חבר את כבל ה- USB Arduino ואת כבל המצלמה. חבר את המחשב החיצוני עם המכשיר באמצעות כבל USB.
כוונן את רגלי החצובה באופן שצינור העדשה מכסה את הדגימה. הפעל את התוכנה, תאר את הדוגמה והתחלת הפעלת מדידה. לכיול הפיגמנטים, הכינו סדרת שורת דילול מתסרון מלאי כפי שמוצג.
פתרון המלאי כלורופיל A צריך להיות מדולל עם דילול אצטון ופיקוריתרין מבוצע עם מים סטריליים מזוקקים. 15 מיליליטר של כל צעד דילול יהיה צורך מאוחר יותר. הגן על הפיגמנטים מפני אור על ידי עטיפתם תחת רדיד אלומיניום.
יש לאחסן את הכלורופיל במקפיא ואת phycoerythrin במקרר עד לשימוש נוסף. לאחר מכן, לבנות ארון תקשורת כפי שמוצג עם הבדל בגובה של 1.5 ס"מ. הוסף חמישה מיליליטר של הדילול המרוכז הגבוה ביותר בבקבוקון פלסטיק פולי-scintillation.
נפח זה משווה לעמוד מים בגובה 15 מ"מ בבקבוקון ומודד את עוצמת הפלואורסצנטיות. לאחר מכן, מניחים את הבקבוקון במיקום האמצעי של המדף ומוסיפים עוד חמישה מיליליטר של אותו פתרון. חזור על ההליך עם עוד חמישה מיליליטר אשר שווה 45 מילימטרים בגובה העמודה.
חזור על ההליך עם כל שלבי הדילול עבור כלורופיל ופיקוריתרין. גובה המדף והעמודה ממלאים תפקיד חשוב במדידה, שכן פני השטח של הנוזלים נמצאים במרכז מכשיר LIFE. לאסוף דגימות שלג וקרח מקרחון.
בנוסף, לאסוף דגימות מחצלת מיקרוביאלית מן שדה הקרחון. במחקר זה נבחר מידטר לאבנברן, קרחון הסמוך למתקני המחקר של ני-אלסונד בארכיפלג הארקטי הגבוה של סבאלברד. ממיסים דגימות שלג וקרח ומסננים ואקום תחת מסנני GF/F.
שים לב לאמצעי האחסון המסונן. לאחר מכן, למדוד את המסננים עם התקן LIFE על ארבעה אזורים אקראיים כל אחד ב triplicates באמצעות לייזר ירוק וכחול. חשב את ריכוז הפיגמנט הכולל על-ידי הכפלת צפיפות האזור עם האזור המסונן והנפח המסונן.
לנרמל את ריכוז הפיגמנט לנפח של ליטר אחד. שים את המסננים בבקבוקון עם 30 מיליליטר של אצטון ולאחסן אותם בחושך בארבע מעלות צליגרד לילה. לאחר מכן, לקחת בקבוקון ולהנח אותו על קרח לפני sonication במשך שתי דקות ב 50% כוח במצב רציף.
לסחוט ולהסיר את המסנן מהבקבוקון. המסנן אינו נחוץ עוד. צרף צינורות טייגון למזרק ולהסיר את תערובת אצטון מיצוי כלורופיל מן הבקבוקון.
החלף את צינורות הטיגון במחזיק מסנן GF5. העבר את הפתרון לתוך קובט קוורץ. לאחר כיול ספקטרומטר הספיגה עבור אצטון, מניחים את המדגם המכיל קובט בספקטרומטר ומודדים את תכונות הספיגה בין 400 ל -750 ננומטר.
לאחר מכן, להסיר את cuvette מן הספקטרומטר ולהוסיף 200 microliters של שתי חומצה הידרוכלורית טוחן לדגימה. לאחר מכן, חזרו על מדידת הספיגה כדי למדוד את תוכן הפופיטין בדגימה. השפעת מדידת הלייזר על פעילות קהילות החיידקים עדיין אינה מתוארת בפירוט.
לכן, ההשפעה נחקרה באמצעות ייצור ראשוני ומשני. לייצור חיידקים, קחו חמישה אליקוטים של מחצלת החיידקים שלנו. שלושה אליקוטים משמשים לקליטת לאוצין עם תווית שטריטום ושני אליקוטים משמשים כפקדים.
בטל את הפעלת הפקדים באמצעות פורמלדהיד. הוסף לאוצין עם תווית טיטניום לכל האליצים. חזור על הליך זה עם כל הדגימות.
כאן, כמות המדגם הנדרשת מוצגת עבור העיצוב הניסיוני שלנו. לאחר מכן, לחשוף את מחצלת החיידקים עם לייזר ירוק וכחול כפי שצוין בהתקנה הניסיונית. לאחר מכן, בטל את כל הדגימות שעדיין לא טופלו בפורמלדהיד.
מעבירים את הדגימה לתוך cryovial ולהוסיף חומצה trichloroacetic או TCA. צנטריפוגה הבקבוקון ב 10, 000 גרם במשך חמש דקות. מוסיפים נוזל תנופה ומכניסים את ההקפאה לבקבוקון פולי-scintillation.
לנתח את הדגימות עם מונה scintillation נוזלי ולחשב את שיעורי ספיגת. לפוטוסינתזה, הכינו חמישה אליקוטים שבעבר שניים מהם חשוכים. הוסף את המעקב הרדיואקטיבי NaH14 CO3 ודגירה במשך ארבע שעות.
לאחר הדגירה, לעצור את התגובה על ידי עטיפת הדגימות בנייר אלומיניום. למדוד התפוררויות לדקה על ידי התפוררות נוזלית כמתואר קודם לכן. לאחר נרמול הנתונים לזמן חשיפה של שנייה אחת וגובה עמודה לדוגמה של 15 מילימטרים, קו הכיול הסופי חושב באמצעות רגרסיה של פואסון.
המתאם בין צפיפות שטח לספירת פוטון הוא תו ליניארי. שיפוע העקומה הוא 81.04. זה אומר שקצב ספירת פוטון של 8, 104 בדגימה שנחשפה לשנייה אחת שווה לצפיפות שטח של 100 ננוגרם לס"מ בריבוע של פיקוריתרין.
סטיית התקן בדגימות מרוכזות גבוהות יותר יכולה להיות מוסברת על ידי תהליך ספיגה עצמית בתוך המדגם. עקומת הכיול Chlorophyll A מציגה מאפיינים דומים ויש לה אופי ליניארי עם שיפוע של 8.94. שש דגימות קרח ושלג מסוננים נמדדו עם מכשיר LIFE לפני מיצוי כלורופיל ומדידות ספקטרום הספיגה הבאות לניתוח תוכן כלורופיל.
הדגימות מסודרות על ידי תוכן הכלורופיל שלהם שנרכש על ידי ספקטרומטריית הספיגה. נתוני LIFE מראים סטיות תקן קטנות שמצביעות על כך שהחומר במסנן חולק באופן שווה יחסית. הכלי LIFE ממעיט בערכו של תוכן הכלורופיל של שלושת המסננים הראשונים.
שלושת המסננים האחרונים, אשר מציגים תוכן כלורופיל נמוך יותר, הם overestimated על ידי מכשיר LIFE. הסיבה לפער הנתונים יכולה להיות מוסברת על ידי עובי עוגת המסנן. ב עוגות מסנן דק, מאויר כתום, אותות פלואורסצנטיים נמוכים נלכדים בשל צפיפות שטח נמוכה של הפיגמנטים.
אותות הכלורופיל A מאוירים באדום בתמונה גולמית זו. כל האזורים האפורים בתמונה גולמית זו מצביעים על כך שהמסנן עצמו מציג אותות הנגרמים על ידי לייזר לאחר שעבר את מסנן המעבר הארוך של 450 ננומטר. התוכנה ספרה באופן מטעה אות זה ככלורופיל פלואורסצנטיות.
תכולת פיגמנט גבוהה לא הוערכה כראוי מכיוון שהלייזר לא יכול היה לגרום לתגובת פלואורסצנטיות במולקולות כלורופיל A בשכבות עמוקות יותר של עוגת המסנן. ניסוי החשיפה ללייזר אינו מצביע על השפעה משמעותית על הפרודוקטיביות הראשונית והמשנית של מחצלות חיידקים. זמן החשיפה בין חמש ל-60 שניות ועוצמת הלייזר הנעה בין 5 ל-50 מילי-וואט לא הראו השפעה כלשהי על תוצאות הפרודוקטיביות.
משמעות הדבר היא כי התעצמויות גבוהות יותר ואת זמני החשיפה הנדרשים כדי לייצר אותות טובים יותר לא יפגע בתאים. ארבעה קריוקוניטים נמדדו במקום והם מושווים עם פתרון סטנדרטי כלורופיל שנמדד בתנאי מעבדה המוצגים באדום. פסגת הפלואורסצנטיות הספקטרלית בכחול תואמת לספקטרום הסטנדרטי של הכלורופיל, ובכך מספקת את המושג מדידות אינטו.
מדידות חיים בוצעו על קרקעות, מחצלות חיידקים, ביופילמים והקפאוקוניטים. מדידות חיים של cryoconites עם שכבת מעים עבה אפשריים אם שטח הפנים מכוסה cryoconite עולה על 12.5 ס"מ בריבוע. סוג זה של קריוקוניט חוסם אור תועה מתחת לקרח.
בשכבות קריוקוניט דקות, אותות הפלואורסצנטיות אפופים באור הסביבה. בהתאם לכך, מדידות LIFE של משטחי קרח חשופים אינן אפשריות בעוד שכל סוגי המדגם האחרים יכולים להיות מנותחים על ידי מכשיר LIFE. שינויי טמפרטורה מובילים לזמינות משופרת של מים נוזליים, מה שמוביל לפעילות ביולוגית גבוהה יותר על משטחי קרחונים.
כתוצאה מכך, ריכוז הפיגמנטים עשוי לעלות. חיוני לעקוב אחר שינויים אלה ולחזות תרחישים עתידיים אפשריים וסבירים.
