이 연구의 전반적인 목표는 극저온 서식지에서 바이오마커의 시상 측정에 사용할 수 있는 새로운 장치를 교정하고 테스트하는 것입니다. 이 장치는 LIFE라고 하는 레이저 유도 형광 방출 기술을 기반으로 합니다. 현재 표준 샘플링 방법은 채석, 치핑 및 톱질에 의한 샘플의 붕괴, 용융에 의한 온도 변화로 인해 시편에 물리적 인 영향을 미칩니다.
이러한 방법은 종종 인 - 인 - 투 조건의 위조로 이어질. 따라서, 미생물 생활의 인-시투 검출 및 특성에 대한 새로운 방법론이 중요합니다. 우리는 높은 공간적 및 시간적 해상도를 가진 새로운 비침습적 비파괴적 방법을 개발했습니다.
레이저 유도 형광 방출 기술의 적용은 supraglacial 환경이 산발성 유기체에 의해, 무엇보다도 거주한다는 사실에 근거한다. 이러한 유기체는 각각 파란색과 녹색 레이저에 의해 흥분되는 포르피린 기반 액세서리 안료 엽록소 A 및 피코에리스린의 형광 패턴의 검출에 의해 추적 될 수있다. 휴대용 듀얼 파장 키트의 무게는 4.5kg이며 외부 컴퓨터와 함께 삼각대에서 사용됩니다.
렌즈 튜브는 시편을 향합니다. 그런 다음, 녹색 5 밀리와트 레이저는 분광계의 광학 축쪽으로 편광 광을 리디렉션 편광 빔 스플리터를 통과 한 후 샘플안타. 표본은 빨간색으로 표시된 형광광을 나타낸다.
충돌된 빛의 절반은 편광 빔 스플리터를 통과하고 레이저 신호를 제거하는 긴 패스 필터를 통해 집중됩니다. 다음으로, 신호는 두 개의 조절 가능한 면도날로 구성된 조리개 슬릿에 닿습니다. 프리즘은 신호가 센서에 캡처되기 전에 미세한 빛 직교선과 슬릿 조리개를 분리합니다.
절차는 파란색 레이저로 반복됩니다. 원시 데이터는 소프트웨어 작업에도 사용되는 휴대용 컴퓨터로 자동으로 전송됩니다. 세 가지 주요 섹션으로 나뉩니다.
노출 조정은 수동으로 수행됩니다. 여기서, 노출 시간과 신호 강도 사이의 보정은 선형이다. 주석 필드는 샘플에 대한 설명에 사용됩니다.
오른쪽 섹션에서는 측정이 완료되는 즉시 원시 이미지가 표시됩니다. 이 기능은 현장에서 즉각적인 데이터 평가에 매우 중요합니다. 빨간색 영역은 노출 시간을 줄임으로써 피할 수 있는 과다 노출 된 픽셀을 나타냅니다.
12비트 그레이스케일 원시 이미지는 CCD 앞프리즘으로 인해 1차원 조리개 슬릿및 스펙트럼 성분으로 인해 공간 구성 요소를 보여줍니다. 광학 제약 조건에 따라 원시 이미지가 왜곡됩니다. 따라서 왜곡 정도를 인식하는 코드를 적용하여 잘라내고 분해해야 합니다.
다음으로, 파장 교정은 532 나노미터 레이저의 도움으로 수행됩니다. 녹색 광은 1, 064 나노 미터 적외선 레이저의 주파수 두 배로 생성됩니다. 두 파장을 CCD에 의해 감지할 수 있으므로 각 픽셀의 스펙트럼 위치를 변형된 이미지로 계산할 수 있습니다.
그런 다음 그림이 지정된 파장 범위로 자른다. 선택한 픽셀 라인의 각 픽셀의 회색 값이 계산되어 요약됩니다. 회색 값은 0에서 255까지 다양할 수 있습니다.
그 후 모든 픽셀 줄은 하나의 숫자를 차지합니다. 이 그래프에서 각 픽셀 선의 회색 값 수가 공간 좌표에 대해 플롯됩니다. 이를 통해 시료 내에서 엽록소와 피코에리스린의 정량적 공간 적 차별을 동시에 할 수 있습니다.
또한 샘플의 스펙트럼 속성은 선택한 픽셀 선에서 플롯할 수 있습니다. 필드 설정은 빠르고 쉽습니다. 삼각대에 기기를 부착합니다.
렌즈 튜브를 장치에 부착합니다. Arduino USB 케이블과 카메라 케이블을 부착합니다. USB 케이블을 사용하여 외부 컴퓨터를 기기와 연결합니다.
렌즈 튜브가 시편을 덮는 방식으로 삼각대 다리를 조정합니다. 소프트웨어를 실행하고 샘플을 설명하고 측정 실행을 시작합니다. 안료 보정을 위해, 표시된 스톡 용액으로부터 희석 행 시리즈를 준비합니다.
엽록소 A 스톡 용액은 아세톤으로 희석되어야 하며, 피코에리스린 희석은 증류살균물로 수행된다. 각 희석 단계의 15 밀리리터가 나중에 필요합니다. 알루미늄 호일 아래에 싸서 색소를 빛으로부터 보호하십시오.
엽록소는 냉동고에 보관하고 피코에리스린을 냉장고에 넣어 추가 사용이 가능합니다. 다음으로 높이 1.5cm의 차이로 랙을 작성합니다. 폴리 신디금 플라스틱 유리병에 가장 높은 농축 희석제 5 밀리리터를 추가합니다.
이 부피는 유리병에 있는 15mm 고수 컬럼과 동일하며 형광 강도를 측정합니다. 그런 다음 유리병을 랙의 중간 위치에 놓고 동일한 솔루션의 5 밀리리터를 추가합니다. 열 높이45밀리미터와 동일한 5밀리리터로 절차를 반복합니다.
엽록소 및 피코에리스린에 대한 모든 희석 단계로 절차를 반복하십시오. 랙과 컬럼 높이는 액체 표면이 LIFE 기기의 초점에 있기 때문에 측정에 중요한 역할을 합니다. 빙하에서 눈과 얼음 샘플을 수집합니다.
또한 빙하 전경에서 미생물 매트 샘플을 수집합니다. 이 연구에서는 스발바르의 북극 군도에 있는 Ny-Alesund의 연구 시설 근처의 빙하인 미드트레 러벤브린(Midtre Lovenbreen)이 선택되었습니다. 눈과 얼음 샘플을 녹이고 GF/F 필터 아래에 진공 필터를 청소합니다.
필터링된 볼륨을 기록합니다. 그런 다음 녹색 및 파란색 레이저를 사용하여 트리플리케이트에서 각각 4개의 무작위 영역에 LIFE 장치로 필터를 측정합니다. 여과된 면적 및 여과된 부피와 영역 밀도를 곱하여 전체 안료 농도를 계산합니다.
안료 농도를 1리터의 부피로 정규화합니다. 필터를 아세톤 30밀리리터로 바이알에 넣고 밤새 섭씨 4도에 어둠 속에서 보관하십시오. 다음으로, 유리병을 가지고 연속 모드에서 50 %의 전력에서 2 분 동안 초음파 처리하기 전에 얼음에 놓습니다.
유리병에서 필터를 짜내고 제거합니다. 필터가 더 이상 필요하지 않습니다. 타이곤 튜빙을 주사기에 부착하고 유리병에서 엽록소 추출 아세톤 믹스를 제거합니다.
타이곤 튜빙을 GF5 필터 홀더로 교체합니다. 솔루션을 쿼츠 큐벳으로 전송합니다. 아세톤용 흡광분광계를 보정한 후, 큐벳을 함유한 샘플을 분광계에 배치하고 400~750나노미터 사이의 흡광도 특징을 측정한다.
다음으로, 분광계에서 큐벳을 제거하고 2개의 어금반 염산의 200 마이크로리터를 시료에 추가합니다. 이어서, 샘플내의 페오피틴 함량을 측정하기 위해 흡광도 측정을 반복한다. 세균 성 지역 사회의 활동에 레이저 측정의 효과는 아직 자세히 설명되지 않습니다.
따라서, 효과는 기본 및 보조 생산을 통해 조사되었습니다. 세균 성 생산을 위해, 우리의 세균 성 매트의 5 알리쿼트걸릴. 트리튬 라벨류 섭취량에 3개의 알리코트가 사용되며 두 개의 알리코트가 컨트롤로 사용됩니다.
포름알데히드로 컨트롤을 비활성화합니다. 모든 알리쿼트에 트리튬 라벨류를 추가합니다. 모든 샘플과 함께 해당 절차를 반복합니다.
여기서, 필요한 샘플 양은 우리의 실험 설계를 위해 표시됩니다. 다음으로, 실험 용 설정에 표시된 바와 같이 녹색과 파란색 레이저로 세균 매트를 노출합니다. 그런 다음 아직 포름알데히드로 처리되지 않은 모든 샘플을 비활성화합니다.
샘플을 극저온으로 옮기고 트리클로로아세트산 또는 TCA를 추가합니다. 유리병을 10, 000g에서 5분간 원심분리합니다. 신경액을 추가하고 극저온을 다중 신경병 바이알에 넣습니다.
액체 신경술 카운터로 샘플을 분석하고 섭취 속도를 계산합니다. 광합성을 위해, 두 개의 어두워진 이전과 같이 5개의 알리쿼트를 준비하십시오. 방사성 추적자 NaH14 CO3를 추가하고 4시간 동안 배양합니다.
인큐베이션 후, 알루미늄 호일로 샘플을 래핑하여 반응을 중지합니다. 앞에서 설명한 바와 같이 액체 신경화에 의한 분당 붕괴를 측정합니다. 1초의 노출 시간 및 15mm의 샘플 컬럼 높이에 대한 데이터를 정규화한 후 푸아송 회귀를 사용하여 최종 교정 라인을 계산하였다.
영역 밀도와 광자 수 간의 상관 관계는 선형 문자가 있습니다. 곡선의 기울기는 81.04입니다. 즉, 1초 동안 노출된 샘플에서 8, 104의 광자 수율은 피코에리스린의 100 나노그램 제곱의 면적 밀도와 같다.
고농축 시료의 표준 편차는 시료 내의 자가 흡수 공정에 의해 설명될 수 있다. 엽록소 A 교정 곡선은 유사한 특성을 나타내며 8.94의 경사면을 가진 선형 문자를 갖는다. 6개의 여과된 얼음 및 눈 샘플은 엽록소 추출 전 LIFE 계측기와 엽록소 함량 분석을 위한 후속 흡광도 스펙트럼 측정으로 측정하였다.
샘플은 흡광도 분광법에 의해 획득된 엽록소 함량에 의해 주문됩니다. LIFE 데이터는 필터의 재료가 비교적 균등하게 분포되었음을 시사하는 작은 표준 편차를 보여줍니다. LIFE 계측기는 처음 세 개의 필터의 엽록소 함량을 과소 평가합니다.
엽록소 함량이 낮은 마지막 세 필터는 LIFE 기기에 의해 과대 평가됩니다. 데이터 차이의 원인은 필터 케이크의 두께에 의해 설명될 수 있다. 주황색으로 표시된 얇은 필터 케이크에서는 안료의 낮은 영역 밀도로 인해 낮은 형광 신호가 포착됩니다.
엽록소 A 신호는 이 원시 이미지에서 빨간색으로 표시됩니다. 이 원시 이미지의 모든 회색 영역은 필터 자체가 450 나노미터 길이 의 필터를 통과 한 후 레이저 유도 신호를 나타낸다는 것을 나타냅니다. 이 소프트웨어는 이 신호를 엽록소 A 형광으로 오해의 소지가 있습니다.
높은 안료 함량은 레이저가 필터 케이크의 깊은 층에서 엽록소 A 분자에서 형광 반응을 유도할 수 없기 때문에 과소 평가되었다. 레이저 노출 실험은 세균 성 매트의 기본 및 이차 생산성에 큰 영향을 미치지 않습니다. 5초에서 60초까지의 노출 시간이나 5~50밀리와트에 이르는 레이저 강도는 생산성 결과에 영향을 미치지 못했습니다.
이것은 더 나은 신호를 생성하는 데 필요한 더 높은 강도와 노출 시간이 세포에 해를 끼치지 않을 것이라는 것을 의미합니다. 4개의 극저온염은 사내에서 측정되었고, 빨간색으로 표시된 실험실 조건하에서 측정된 엽록소 표준 용액과 비교됩니다. 청색의 스펙트럼 형광 피크는 엽록소 표준 스펙트럼과 일치하므로 시상 측정의 개념을 제공합니다.
생명 측정은 토양, 세균 매트, 생물막 및 극저온염에서 수행되었습니다. 극저온으로 덮인 표면적이 12.5cm 제곱을 초과하는 경우 두꺼운 퇴적층층이 있는 극저온염의 생명 측정이 가능합니다. 이 유형의 극저코노이트(cryoconite)는 얼음 아래에서 길 잃은 빛을 차단합니다.
얇은 극저온층에서는 형광 신호가 주변 광에 의해 가려집니다. 이에 따라, 베어 아이스 표면의 LIFE 측정은 불가능하지만 다른 모든 샘플 유형은 LIFE 계측기에서 분석할 수 있다. 온도 변화는 빙하 표면에 더 높은 생물학적 활동을 초래 액체 물의 가용성 향상으로 이어질.
결과적으로, 안료 농도가 증가할 수 있다. 이러한 변경 사항을 모니터링하고 향후 가능한 시나리오를 예측하는 것이 중요합니다.
