Laserinduzierte Fluoreszenzemission (L.I.F.E.) als neuartiges nichtinvasives Werkzeug zur In-Situ-Messung von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, ein neuartiges Gerät zu kalibrieren und zu testen, das für In-situ-Messungen von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen verwendet werden kann. Das Gerät basiert auf der laserinduzierten Fluoreszenz-Emissionstechnologie, die als LIFE bezeichnet wird. Die derzeitigen Standard-Probenahmeverfahren führen zu physikalischen Auswirkungen auf die Probe aufgrund von Steinbruch, Zerfall von Proben durch Absplittern und Sägen und Temperaturverschiebung durch Schmelzen.

Diese Methoden führen oft zur Fälschung von In-situ-Bedingungen. Daher ist eine neue Methodik zur In-situ-Erkennung und Charakterisierung von mikrobiellem Leben von entscheidender Bedeutung. Wir haben eine neuartige nicht-invasive, zerstörungsfreie Methode mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung entwickelt.

Die Anwendung einer laserinduzierten Fluoreszenzemissionstechnik basiert auf der Tatsache, dass supraglaziale Umgebungen unter anderem von phototropen Organismen bewohnt werden. Diese Organismen können durch den Nachweis von fluoreszierenden Mustern der porphyrinbasierten Zubehörpigmente Chlorophyll A und Phycoerythrin, die jeweils durch einen blauen und grünen Laser angeregt werden, zurückverfolgt werden. Das tragbare Dual-Wellenlängen-Kit wiegt 4,5 Kilogramm und wird auf einem Stativ in Kombination mit einem externen Computer verwendet.

Das Linsenrohr ist auf die Probe gerichtet. Dann trifft ein grüner Fünf-Milliwatt-Laser die Probe, nachdem er einen polarisierenden Strahlsplitter passiert hat, der polarisiertes Licht in Richtung der optischen Achse des Spektrometers umleitet. Das Exemplar zeigt ein rot dargestelltes Fluoreszenzlicht.

Die Hälfte des kollimierten Lichts passiert den Polarisationsstrahlteiler und wird durch einen Langpassfilter fokussiert, der die Lasersignale entfernt. Als nächstes trifft das Signal auf einen Blendenschlitz, der aus zwei verstellbaren Rasierklingen besteht. Ein Prisma trennt spektral eine feine Linie von leichtem Orthogonal zur Schlitzöffnung, bevor das Signal auf einem Sensor erfasst wird.

Das Verfahren wird mit dem blauen Laser wiederholt. Die Rohdaten werden automatisch an einen tragbaren Computer übertragen, der auch für den Softwarebetrieb verwendet wird. Es ist in drei Hauptabschnitte unterteilt.

Die Belichtungseinstellung erfolgt manuell. Hier ist die Korrektur zwischen Belichtungszeit und Signalintensität linear. Das Kommentarfeld wird für die Beschreibung eines Beispiels verwendet.

Im rechten Bereich werden Rohbilder angezeigt, sobald die Messung abgeschlossen ist. Diese Funktion ist für die sofortige Datenauswertung vor Ort von entscheidender Bedeutung. Rote Bereiche zeigen überbelichtete Pixel an, die durch Eine Verkürzung der Belichtungszeit vermieden werden können.

Die 12-Bit-Graustufen-Rohbilder zeigen eine räumliche Komponente aufgrund des eindimensionalen Blendenschlitzes und eine Spektralkomponente aufgrund des Prismas vor dem CCD. Als Reaktion auf optische Einschränkungen werden die Rohbilder verzerrt. Daher müssen sie beschnitten und entzerrt werden, indem ein Code angewendet wird, der den Grad der Verzerrung erkennt.

Als nächstes erfolgt die Wellenlängenkalibrierung mit Hilfe des 532 Nanometer Lasers. Das grüne Licht wird durch Frequenzverdoppelung von 1, 064 Nanometer Infrarotlaser erzeugt. Beide Wellenlängen können von der CCD erfasst werden und somit kann die Spektralposition jedes Pixels in entzerrten Bildern berechnet werden.

Anschließend wird das Bild auf einen bestimmten Wellenlängenbereich heruntergeschnitten. Graue Werte aus jedem Pixel in einer ausgewählten Pixellinie werden gezählt und summiert. Ein Grauwert kann zwischen Null und 255 liegen.

Danach ist jede Pixellinie für eine Zahl. In diesem Diagramm werden die Grauwertzahlen jeder Pixellinie anhand der räumlichen Koordinaten dargestellt. Dies ermöglicht eine quantitative räumliche Diskriminierung von Chlorophyll und Phycoerythrin gleichzeitig innerhalb der Probe.

Darüber hinaus können die spektralen Eigenschaften eines Samples aus ausgewählten Pixellinien gezeichnet werden. Die Feldeinrichtung ist schnell und einfach. Befestigen Sie das Instrument auf einem Stativ.

Befestigen Sie das Linsenrohr am Gerät. Schließen Sie das Arduino USB-Kabel und das Kamerakabel an. Schließen Sie den externen Computer über ein USB-Kabel mit dem Gerät an.

Passen Sie die Stativbeine so an, dass das Linsenrohr die Probe bedeckt. Führen Sie die Software aus, beschreiben Sie das Beispiel, und starten Sie einen Messlauf. Für die Pigmentkalibrierung eine Verdünnungsreihenserie aus einer Serienlösung wie dargestellt vorbereiten.

Die Chlorophyll-A-Stammlösung muss mit Aceton verdünnt werden und die Verdünnung von Phycoerythrin wird mit destilliertem sterilem Wasser durchgeführt. Fünfzehn Milliliter pro Verdünnungsschritt werden später benötigt. Schützen Sie die Pigmente vor Licht, indem Sie sie unter Aluminiumfolie wickeln.

Chlorophyll in einem Gefrierschrank und das Phycoerythrin bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahren. Als nächstes bauen Sie ein Rack, wie gezeigt mit einem Höhenunterschied von 1,5 Zentimetern gezeigt. Fügen Sie fünf Milliliter der höchsten konzentrierten Verdünnung in eine Poly-Szintillations-Kunststoff-Durchstechflasche.

Dieses Volumen entspricht einer 15 Millimeter hohen Wassersäule in der Durchstechflasche und misst die Fluoreszenzintensität. Legen Sie dann die Durchstechflasche in die mittlere Position des Racks und fügen Sie weitere fünf Milliliter der gleichen Lösung hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang mit weiteren fünf Millilitern, was 45 Millimetern in Spaltenhöhe entspricht.

Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Verdünnungsschritten für Chlorophyll und Phycoerythrin. Die Rack- und Säulenhöhe spielen eine wichtige Rolle für die Messung, da die Oberfläche der Flüssigkeiten im Mittelpunkt des LIFE-Instruments liegt. Sammeln Sie Schnee- und Eisproben von einem Gletscher.

Sammeln Sie zusätzlich mikrobielle Mattenproben aus dem Gletschervorfeld. In dieser Studie wurde Midtre Lovenbreen ausgewählt, ein Gletscher in der Nähe der Forschungseinrichtungen von Ny-Alesund im hocharktischen Archipel von Spitzbergen. Schnee- und Eisproben schmelzen und unter GF/F-Filtern vakuumfiltern.

Beachten Sie das gefilterte Volume. Messen Sie dann die Filter mit dem LIFE-Gerät auf vier zufälligen Bereichen in Dreiern mit dem grünen und blauen Laser. Berechnen Sie die Gesamtpigmentkonzentration, indem Sie die Flächendichte mit der gefilterten Fläche und dem gefilterten Volumen multiplizieren.

Normalisieren Sie die Pigmentkonzentration auf ein Volumen von einem Liter. Die Filter in eine Durchstechflasche mit 30 Milliliter Aceton geben und über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln lagern. Als nächstes nehmen Sie eine Durchstechflasche und legen Sie sie vor der Beschallung zwei Minuten lang bei 50 % Leistung im kontinuierlichen Modus auf Eis.

Drücken und entfernen Sie den Filter aus der Durchstechflasche. Der Filter wird nicht mehr benötigt. Tygon-Schläuche an einer Spritze befestigen und die Chlorophyll-Extraktionsacetonmischung aus der Durchstechflasche entfernen.

Ersetzen Sie den Tygon-Schlauch durch einen GF5-Filterhalter. Übertragen Sie die Lösung in eine Quarzküvette. Nach der Kalibrierung des Absorptionsspektrometers für Aceton legen Sie die Mitküvette enthaltende Probe in das Spektrometer und messen die Absorptionsmerkmale zwischen 400 und 750 Nanometern.

Als nächstes entfernen Sie die Küvette aus dem Spektrometer und fügen Sie der Probe 200 Mikroliter zweimollaren Salzsäure hinzu. Wiederholen Sie dann die Absorptionsmessung, um den Phäophytingehalt in der Probe zu messen. Die Wirkung der Lasermessung auf die Aktivität bakterieller Gemeinschaften wird noch nicht im Detail beschrieben.

Daher wurde der Effekt über die Primär- und Sekundärproduktion untersucht. Für die bakterielle Produktion, nehmen Sie fünf Aliquots unserer bakteriellen Matte. Für die Tritium-etikettierte Leucinaufnahme werden drei Aliquots und als Kontrollen zwei Aliquots verwendet.

Inaktivieren Sie die Kontrollen mit Formaldehyd. Fügen Sie Tritium-markiertes Leucin zu allen Aliquots hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Beispielen.

Hier wird die benötigte Probenmenge für unser experimentelles Design angezeigt. Als nächstes, belichten Sie die bakterielle Matte mit dem grünen und blauen Laser, wie im Versuchsaufbau angegeben. Dann inaktivieren Sie alle Proben, die noch nicht mit Formaldehyd behandelt wurden.

Die Probe in eine Kryovial geben und Trichloressigsäure oder TCA hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Durchstechflasche bei 10.000 g für fünf Minuten. Scintillationsflüssigkeit hinzufügen und das Kryovial in eine Poly-Szintillations-Durchstechflasche geben.

Analysieren Sie die Proben mit einem flüssigen Szintillationszähler und berechnen Sie die Aufnahmeraten. Für die Photosynthese fünf Aliquots wie zuvor vorbereiten, von denen zwei verdunkelt sind. Fügen Sie den radioaktiven Tracer NaH14 CO3 hinzu und inkubieren Sie ihn vier Stunden lang.

Beenden Sie nach der Inkubation die Reaktion, indem Sie die Proben in Aluminiumfolie einwickeln. Messen Sie Disintegrationen pro Minute durch Flüssigszintillation, wie zuvor beschrieben. Nach normalisierender Daten für eine Belichtungszeit von einer Sekunde und eine Probenspaltenhöhe von 15 Millimetern wurde die endgültige Kalibrierlinie mit einer Poisson-Regression berechnet.

Die Korrelation zwischen Flächendichte und Photonenzahl hat einen linearen Charakter. Die Steigung der Kurve ist 81.04. Das bedeutet, dass eine Photonenanzahl von 8, 104 in einer Probe, die für eine Sekunde exponiert wurde, einer Flächendichte von 100 Nanogramm pro Zentimeter Quadrat des Phycoerythrins entspricht.

Die Standardabweichung in höher konzentrierten Proben kann durch einen Selbstabsorptionsprozess innerhalb der Probe erklärt werden. Die Chlorophyll-A-Kalibrierkurve weist ähnliche Eigenschaften auf und hat einen linearen Charakter mit einer Neigung von 8,94. Sechs gefilterte Eis- und Schneeproben wurden mit dem LIFE-Instrument vor der Chlorophyllextraktion und anschließenden Absorptionsspektrummessungen für die Chlorophyllgehaltsanalyse gemessen.

Die Proben werden nach ihrem Chlorophyllgehalt sortiert, der durch die Absorptionsspektrometrie erfasst wird. Die LIFE-Daten zeigen kleine Standardabweichungen, was darauf hindeutet, dass das Material auf dem Filter relativ gleichmäßig verteilt war. Das LIFE-Instrument unterschätzt den Chlorophyllgehalt der ersten drei Filter.

Die letzten drei Filter, die einen niedrigeren Chlorophyllgehalt aufweisen, werden vom LIFE-Instrument überschätzt. Der Grund für die Datenunterschiede lässt sich durch die Dicke des Filterkuchens erklären. In dünnen Filterkuchen, in Orange dargestellt, werden niedrige Fluoreszenzsignale aufgrund geringer Flächendichten der Pigmente erfasst.

Die Chlorophyll-A-Signale sind in diesem Rohbild rot dargestellt. Alle Graubereiche in diesem Rohbild zeigen an, dass der Filter selbst laserinduzierte Signale aufweist, nachdem er den 450 Nanometer Langpassfilter passiert hat. Die Software zählte dieses Signal irreführend als Chlorophyll-A-Fluoreszenz.

Hohe Pigmentgehalte wurden unterschätzt, da der Laser keine Fluoreszenzreaktion in Chlorophyll-A-Molekülen in tieferen Schichten des Filterkuchens auslösen konnte. Das Laser-Expositionsexperiment zeigt keine signifikanten Auswirkungen auf die primäre und sekundäre Produktivität von Bakterienmatten. Weder die Belichtungszeit von fünf bis 60 Sekunden noch die Laserintensität von fünf bis 50 Milliwatt zeigten einen Einfluss auf die Produktivitätsergebnisse.

Dies impliziert, dass die höheren Intensitäten und Belichtungszeiten, die erforderlich sind, um bessere Signale zu erzeugen, den Zellen nicht schaden würden. Vier Kryokoniten wurden vor Ort gemessen und mit chlorophyll-Standardlösung verglichen, die unter Laborbedingungen in Rot gemessen wurde. Die spektralen Fluoreszenzspitzen in Blau stimmten mit dem Chlorophyll-Standardspektrum überein und lieferten so das Konzept der In-situ-Messungen.

LIFE-Messungen wurden an Böden, Bakterienmatten, Biofilmen und Kryokoniten durchgeführt. LIFE-Messungen von Kryokoniten mit einer dicken Sedimentschicht sind möglich, wenn die kryokonitbedeckte Oberfläche 12,5 Zentimeter quadratisch überschreitet. Diese Art von Kryokonit blockiert streunen Licht unter dem Eis.

In dünnen Kryokonitschichten werden die Fluoreszenzsignale von Umgebungslicht umhüllt. Dementsprechend sind LIFE-Messungen von nackten Eisflächen nicht möglich, während alle anderen Probentypen mit dem LIFE-Instrument analysiert werden können. Temperaturänderungen führen zu einer verbesserten Verfügbarkeit von flüssigem Wasser, was zu einer höheren biologischen Aktivität auf Gletscheroberflächen führt.

Infolgedessen kann die Pigmentkonzentration zunehmen. Es ist von entscheidender Bedeutung, diese Änderungen zu überwachen und mögliche und wahrscheinliche zukünftige Szenarien vorherzusagen.