Emisión de Fluorescencia Inducida por Láser (L.I.F.E.) como Novedosa Herramienta No Invasiva para Mediciones In-Situ de Biomarcadores en Hábitats Criosféricos

El objetivo general de este estudio es calibrar y probar un nuevo dispositivo que se puede utilizar para mediciones in situ de biomarcadores en hábitats criosféricos. El dispositivo se basa en la tecnología de emisión de fluorescencia inducida por láser, conocida como LIFE. Los métodos de muestreo estándar actuales conducen a impactos físicos en la muestra debido a la cantera, la desintegración de muestras mediante astillado y aserrado, y el cambio de temperatura por fusión.

Estos métodos a menudo conducen a la falsificación de condiciones in situ. Por lo tanto, una nueva metodología para la detección in situ y la caracterización de la vida microbiana es crucial. Hemos desarrollado un novedoso método no invasivo, no destructivo con una alta resolución espacial y temporal.

La aplicación de una técnica de emisión de fluorescencia inducida por láser se basa en el hecho de que los ambientes supraglaciales están habitados, entre otras cosas, por organismos fototrópicos. Estos organismos pueden ser rastreados por la detección de patrones fluorescentes de los pigmentos accesorios basados en porfirina clorofila A y ficoerythrin que se excitan por un láser azul y verde respectivamente. El kit portátil de doble longitud de onda pesa 4,5 kilogramos y se utiliza en un trípode en combinación con un ordenador externo.

El tubo de la lente se dirige hacia la muestra. Luego, un láser verde de cinco milivatios golpea la muestra después de pasar un divisor de haz polarizador que redirige la luz polarizada hacia el eje óptico del espectrómetro. El espécimen exhibe una luz fluorescente ilustrada en rojo.

La mitad de la luz colimada pasa el divisor de haz polarizador y se enfoca a través de un filtro de paso largo que elimina las señales láser. A continuación, la señal golpea una abertura que consta de dos cuchillas de afeitar ajustables. Un prisma separa espectralmente una fina línea de luz ortogonal a la abertura de la ranura antes de que la señal se capture en un sensor.

El procedimiento se repite con el láser azul. Los datos sin procesar se transfieren automáticamente a un ordenador portátil que también se utiliza para el funcionamiento del software. Se divide en tres secciones principales.

El ajuste de la exposición se realiza manualmente. Aquí, la corrección entre el tiempo de exposición y la intensidad de la señal es lineal. El campo de comentario se utiliza para la descripción de un ejemplo.

En la sección derecha, las imágenes sin procesar se muestran tan pronto como finaliza la medición. Esta característica es crucial para la evaluación inmediata de datos en el campo. Las áreas rojas indican píxeles sobreexpuestos que se pueden evitar reduciendo el tiempo de exposición.

Las imágenes sin procesar en escala de grises de 12 bits muestran un componente espacial debido a la abertura unidimensional y un componente espectral debido al prisma delante del CCD. En respuesta a restricciones ópticas, las imágenes sin procesar se distorsionan. Por lo tanto, deben recortarse y deswarped aplicando un código que reconozca el grado de distorsión.

A continuación, la calibración de la longitud de onda se realiza con la ayuda del láser de 532 nanómetros. La luz verde se produce por duplicación de frecuencia de 1, 064 nanometer láser infrarrojo. Ambas longitudes de onda pueden ser detectadas por el CCD y, por lo tanto, la posición espectral de cada píxel se puede calcular en imágenes desen guerra.

A continuación, la imagen se recorta a un rango de longitud de onda determinado. Los valores grises de cada píxel de una línea de píxel seleccionada se cuentan y se suturan. Un valor gris puede variar de cero a 255.

Después de eso, cada línea de píxeles representa un número. En este gráfico, los recuentos de valores grises de cada línea de píxeles se trazan con las coordenadas espaciales. Esto permite una discriminación espacial cuantitativa de clorofila y fitoerytrina simultáneamente dentro de la muestra.

Además, las propiedades espectrales de una muestra se pueden trazar a partir de las líneas de píxel seleccionadas. La configuración de campo es rápida y fácil. Coloque el instrumento en un trípode.

Conecte el tubo de la lente al dispositivo. Conecte el cable USB Arduino y el cable de la cámara. Conecte el ordenador externo con el instrumento mediante un cable USB.

Ajuste las patas del trípode de manera que el tubo de la lente cubra la muestra. Ejecute el software, describa la muestra e inicie una ejecución de medición. Para la calibración del pigmento, prepare una serie de hileras de dilución a partir de una solución de stock como se muestra.

La solución de la clorofila A debe diluirse con acetona y la dilución de la fitoerytrina se realiza con agua estéril destilada. Quince mililitros de cada paso de dilución serán necesarios más adelante. Proteja los pigmentos de la luz envolviéndolos bajo papel de aluminio.

Conservar la clorofila en un congelador y la fitoerytrina en nevera hasta su uso posterior. A continuación, construya un bastidor como se muestra con una diferencia de altura de 1,5 centímetros. Añadir cinco mililitros de la dilución concentrada más alta en un vial de plástico de poliesttilación.

Este volumen equivale a una columna de agua de 15 milímetros de altura en el vial y mide la intensidad de la fluorescencia. A continuación, coloque el vial en la posición central del bastidor y agregue otros cinco mililitros de la misma solución. Repita el procedimiento con otros cinco mililitros que equivalen a 45 milímetros de altura de columna.

Repita el procedimiento con todos los pasos de dilución para clorofila y fitoerytrina. La altura del bastidor y la columna desempeñan un papel importante para la medición, ya que la superficie de los líquidos se encuentra en el punto focal del instrumento LIFE. Recoge muestras de nieve y hielo de un glaciar.

Además, recoja muestras de esteras microbianas del campo del glaciar. En este estudio, Midtre Lovenbreen, un glaciar cercano a las instalaciones de investigación de Ny-Alesund en el alto archipiélago ártico de Svalbard fue elegido. Derretir las muestras de nieve y hielo y filtrarlas al vacío bajo los filtros GF/F.

Observe el volumen filtrado. A continuación, mida los filtros con el dispositivo LIFE en cuatro áreas aleatorias cada una en triplicados usando el láser verde y azul. Calcule la concentración total de pigmento multiplicando la densidad de área con el área filtrada y el volumen filtrado.

Normalizar la concentración de pigmento a un volumen de un litro. Poner los filtros en un vial con 30 mililitros de acetona y almacenarlos en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante la noche. A continuación, tome un vial y colóquelo sobre hielo antes de la sonicación durante dos minutos a una potencia del 50% en modo continuo.

Apriete y retire el filtro del vial. El filtro ya no es necesario. Coloque el tubo Tygon en una jeringa y retire la mezcla de acetona de extracción de clorofila del vial.

Sustituya el tubo Tygon por un soporte de filtro GF5. Transfiera la solución a una cubeta de cuarzo. Después de calibrar el espectrómetro de absorbancia para la acetona, coloque la muestra que contiene la cubeta en el espectrómetro y mida las características de absorbancia entre 400 y 750 nanómetros.

A continuación, retire la cubeta del espectrómetro y añada 200 microlitros de dos molares de ácido clorhídrico a la muestra. A continuación, repita la medición de absorbancia para medir el contenido de feofitina en la muestra. El efecto de la medición láser en la actividad de las comunidades bacterianas aún no se describe en detalle.

Por lo tanto, el efecto se ha investigado a través de la producción primaria y secundaria. Para la producción bacteriana, tome cinco alícuotas de nuestra estera bacteriana. Se utilizan tres alícuotas para la captación de leucina con etiqueta de tritio y dos alícuotas como controles.

Inactivar los controles con formaldehído. Añadir leucina etiquetada con tritio a todas las alícuotas. Repita ese procedimiento con todas las muestras.

Aquí, se muestra la cantidad de muestra requerida para nuestro diseño experimental. A continuación, exponga la estera bacteriana con el láser verde y azul como se indica en la configuración experimental. Luego, inactivar todas las muestras que aún no fueron tratadas con formaldehído.

Transfiera la muestra a una crioovial y agregue ácido tricloroacético o TCA. Centrifugar el vial a 10.000 g durante cinco minutos. Añadir líquido de centelleo y poner el criovial en un vial de poli-scintilación.

Analice las muestras con un contador de centelleo líquido y calcule las tasas de absorción. Para la fotosíntesis, preparar cinco alícuotas como antes de las cuales dos se oscurecen. Añadir el marcador radioactivo NaH14 CO3 e incubar durante cuatro horas.

Después de la incubación, detenga la reacción envolviendo las muestras en papel de aluminio. Mida las desintegraciones por minuto por centelleo líquido como se describió anteriormente. Después de normalizar los datos para un tiempo de exposición de un segundo y una altura de columna de muestra de 15 milímetros, la línea de calibración final se calculó utilizando una regresión de Poisson.

La correlación entre la densidad de área y los recuentos de fotones tiene un carácter lineal. La pendiente de la curva es 81.04. Eso significa que una tasa de recuento de fotones de 8, 104 en una muestra expuesta durante un segundo equivale a una densidad de área de 100 nanogramos por centímetro cuadrado de fitoerytrina.

La desviación estándar en muestras concentradas más altas se puede explicar mediante un proceso de autoabsorción dentro de la muestra. La curva de calibración de clorofila A muestra características similares y tiene un carácter lineal con una pendiente de 8,94. Se midieron seis muestras de hielo y nieve filtradas con el instrumento LIFE antes de la extracción de clorofila y las mediciones posteriores del espectro de absorbancia para el análisis del contenido de clorofila.

Las muestras son ordenadas por su contenido de clorofila adquirida por la espectrometría de absorbancia. Los datos LIFE muestran pequeñas desviaciones estándar que sugieren que el material en el filtro se distribuyó relativamente por igual. El instrumento LIFE subestima el contenido de clorofila de los tres primeros filtros.

Los tres últimos filtros, que muestran un menor contenido de clorofila, son sobreestimados por el instrumento LIFE. La razón de la disparidad de datos se puede explicar por el grosor de la torta de filtro. En las tortas de filtro fino, ilustradas en naranja, las señales de baja fluorescencia se capturan debido a las bajas densidades de área de los pigmentos.

Las señales de clorofila A se ilustran en rojo en esta imagen cruda. Todas las áreas grises de esta imagen cruda indican que el filtro en sí exhibe señales inducidas por láser después de pasar el filtro de paso largo de 450 nanómetros. El software contó engañosamente esta señal como clorofila A fluorescencia.

El alto contenido de pigmentos fue subestimado porque el láser no podía inducir la respuesta a la fluorescencia en moléculas de clorofila A en capas más profundas de la torta de filtro. El experimento de exposición láser no indica ningún efecto significativo en la productividad primaria y secundaria de las esteras bacterianas. Ni el tiempo de exposición de cinco a 60 segundos ni la intensidad del láser que oscila entre cinco y 50 milivatios mostraron ningún efecto en los resultados de productividad.

Esto implica que las intensidades más altas y los tiempos de exposición requeridos para producir mejores señales no dañarían las células. Cuatro crioconitas se midieron in situ y se comparan con la solución estándar de clorofila que se midió en condiciones de laboratorio mostradas en rojo. Los picos de fluorescencia espectral en azul coincidieron con el espectro estándar de clorofila, proporcionando así el concepto de mediciones in situ.

Las mediciones LIFE se han realizado en suelos, esteras bacterianas, biopelículas y crioconitas. Las mediciones LIFE de crioconitas con una gruesa capa de sedimentos son posibles si la superficie cubierta de crioconita supera los 12,5 centímetros cuadrados. Este tipo de crioconita bloquea la luz extraviada de debajo del hielo.

En las finas capas de crioconita, las señales de fluorescencia están envueltas por la luz ambiental. En consecuencia, las mediciones LIFE de superficies de hielo desnudo no son posibles, mientras que todos los demás tipos de muestras pueden ser analizados por el instrumento LIFE. Los cambios de temperatura conducen a una mayor disponibilidad de agua líquida, lo que resulta en una mayor actividad biológica en las superficies de los glaciares.

Como consecuencia, la concentración de pigmento puede aumentar. Es crucial supervisar estos cambios y predecir escenarios posibles y probables en el futuro.