Emissão de Fluorescência Induzida por Laser (L.I.F.E.) como nova ferramenta não invasiva para medições insitu de biomarcadores em habitats criosféricos

O objetivo geral deste estudo é calibrar e testar um novo dispositivo que pode ser usado para medições in situ de biomarcadores em habitats criosféricos. O dispositivo é baseado na tecnologia de emissão de fluorescência induzida pelo laser, conhecida como LIFE. Os métodos de amostragem padrão atuais levam a impactos físicos na amostra devido à pedreira, desintegração de amostras por picar e serrar, e mudança de temperatura por derretimento.

Esses métodos muitas vezes levam à falsificação de condições in situ. Portanto, uma nova metodologia para a detecção in situ e caracterização da vida microbiana é crucial. Desenvolvemos um novo método não invasivo, não destrutivo, com alta resolução espacial e temporal.

A aplicação de uma técnica de emissão de fluorescência induzida por laser baseia-se no fato de que ambientes supraglaciais são habitados, entre outras coisas, por organismos fototrópicos. Esses organismos podem ser rastreados pela detecção de padrões fluorescentes dos pigmentos acessórios à base de porfirina clorofila A e ficoerythrin que são animados por um laser azul e verde, respectivamente. O kit portátil de comprimento de onda dupla pesa 4,5 kg e é usado em um tripé em combinação com um computador externo.

O tubo da lente é direcionado para o espécime. Em seguida, um laser verde de cinco miliwatts atinge a amostra depois de passar um divisor de feixe polarizador que redireciona a luz polarizada em direção ao eixo óptico do espectrômetro. O espécime exibe uma luz fluorescente ilustrada em vermelho.

Metade da luz colidida passa pelo divisor de feixes polarizadores e é focada através de um filtro de passagem longa que remove os sinais de laser. Em seguida, o sinal atinge uma fenda de abertura que consiste em duas lâminas de barbear ajustáveis. Um prisma espectralmente separa uma linha tênue de luz ortogonal à abertura da fenda antes que o sinal seja capturado em um sensor.

O procedimento é repetido com o laser azul. Os dados brutos são transferidos automaticamente para um computador portátil que também é usado para a operação do software. É dividido em três seções principais.

O ajuste de exposição é feito manualmente. Aqui, a correção entre o tempo de exposição e a intensidade do sinal é linear. O campo de comentários é usado para a descrição de uma amostra.

Na seção direita, as imagens brutas são exibidas assim que a medição é concluída. Esse recurso é crucial para avaliação imediata de dados no campo. As áreas vermelhas indicam pixels superexpostos que podem ser evitados reduzindo o tempo de exposição.

As imagens brutas em escala de cinza de 12 bits mostram um componente espacial devido à fenda de abertura unidimensional e um componente espectral devido ao prisma em frente ao CCD. Em resposta a restrições ópticas, as imagens brutas são distorcidas. Portanto, eles precisam ser cortados e dejustados aplicando um código que reconheça o grau de distorção.

Em seguida, a calibração do comprimento de onda é feita com a ajuda do laser de 532 nanômetros. A luz verde é produzida pela duplicação de frequência de 1.064 nanômetros de laser infravermelho. Ambos os comprimentos de onda podem ser detectados pelo CCD e, portanto, a posição espectral de cada pixel pode ser calculada em imagens desajustadas.

Em seguida, a imagem é cortada para um determinado alcance de comprimento de onda. Os valores cinzentos de cada pixel em uma linha de pixels selecionadas são contados e resumidos. Um valor cinza pode variar de zero a 255.

Depois disso, cada linha pixel é responsável por um número. Neste gráfico, as contagens de valor cinza de cada linha de pixels são plotadas contra as coordenadas espaciais. Isso permite uma discriminação espacial quantitativa de clorofila e ficoerthrina simultaneamente dentro da amostra.

Além disso, as propriedades espectrais de uma amostra podem ser plotadas a partir de linhas de pixel selecionadas. A configuração de campo é rápida e fácil. Coloque o instrumento em um tripé.

Conecte o tubo da lente ao dispositivo. Conecte o cabo USB Arduino e o cabo da câmera. Conecte o computador externo com o instrumento usando um cabo USB.

Ajuste as pernas do tripé de forma que o tubo da lente cubra a amostra. Execute o software, descreva a amostra e inicie uma execução de medição. Para a calibração do pigmento, prepare uma série de linhas de diluição a partir de uma solução de estoque como exibida.

A solução de estoque clorofila A precisa ser diluída com diluição de acetona e ficoertorina é realizada com água estéril destilada. Quinze mililitros de cada etapa de diluição serão necessários mais tarde. Proteja os pigmentos da luz embrulhando-os sob papel alumínio.

Guarde a clorofila em um congelador e a ficoerthrina em uma geladeira até que use mais. Em seguida, construa um rack como mostrado com uma diferença de altura de 1,5 centímetros. Adicione cinco mililitros da diluição concentrada mais alta em um frasco plástico de poli-cintilação.

Este volume equivale a uma coluna de água de 15 milímetros de altura no frasco e mede a intensidade da fluorescência. Em seguida, coloque o frasco na posição do meio do rack e adicione mais cinco mililitros da mesma solução. Repita o procedimento com outros cinco mililitros que equivalem a 45 milímetros de altura da coluna.

Repita o procedimento com todas as etapas de diluição para clorofila e ficoerthrina. A altura do rack e da coluna desempenham um papel importante para a medição, uma vez que a superfície dos líquidos está no ponto focal do instrumento LIFE. Colete amostras de neve e gelo de uma geleira.

Além disso, colete amostras de tapete microbiano do campo de geleiras. Neste estudo, midtre Lovenbreen, uma geleira próxima às instalações de pesquisa de Ny-Alesund no alto arquipélago ártico de Svalbard foi escolhida. Derreta as amostras de neve e gelo e o vácuo os filtra sob filtros GF/F.

Observe o volume filtrado. Em seguida, meça os filtros com o dispositivo LIFE em quatro áreas aleatórias cada em triplicados usando o laser verde e azul. Calcule a concentração geral do pigmento multiplicando a densidade da área com a área filtrada e o volume filtrado.

Normalize a concentração de pigmento a um volume de um litro. Coloque os filtros em um frasco com 30 mililitros de acetona e armazene-os no escuro a quatro graus centígrados durante a noite. Em seguida, pegue um frasco e coloque-o no gelo antes da sônica por dois minutos a 50% de potência no modo contínuo.

Aperte e remova o filtro do frasco. O filtro não é mais necessário. Conecte a tubulação de Tygon a uma seringa e remova a mistura de acetona de extração de clorofila do frasco.

Substitua a tubulação Tygon por um suporte de filtro GF5. Transfira a solução para um cuvette de quartzo. Depois de calibrar o espectrômetro de absorvância para acetona, coloque a amostra contendo cuvette no espectrômetro e meça as características de absorção entre 400 e 750 nanômetros.

Em seguida, remova o cuvette do espectrômetro e adicione 200 microliters de dois ácidos clorídricos molares à amostra. Em seguida, repita a medição de absorvência para medir o teor de feofiltina na amostra. O efeito da medição do laser sobre a atividade das comunidades bacterianas ainda não está descrito em detalhes.

Portanto, o efeito tem sido investigado via produção primária e secundária. Para produção bacteriana, tome cinco alíquotas do nosso tapete bacteriano. Três alíquotas são usadas para a captação de leucina rotulada por trítio e duas alíquotas são usadas como controles.

Inativar os controles com formaldeído. Adicione leucina rotulada de trítio a todas as alíquotas. Repita esse procedimento com todas as amostras.

Aqui, a quantidade amostral necessária é mostrada para o nosso design experimental. Em seguida, exponha o tapete bacteriano com o laser verde e azul, conforme indicado na configuração experimental. Em seguida, inativar todas as amostras que ainda não foram tratadas com formaldeído.

Transfira a amostra para um criovial e adicione ácido tricloroacético ou TCA. Centrifugar o frasco a 10.000 g por cinco minutos. Adicione líquido de cintilação e coloque o criovial em um frasco de poli-cintilação.

Analise as amostras com um contador de cintilação líquida e calcule as taxas de absorção. Para fotossíntese, prepare cinco alíquotas como antes das quais duas estão escurecidas. Adicione o rastreador radioativo NaH14 CO3 e incubar por quatro horas.

Após a incubação, pare a reação embrulhando as amostras em papel alumínio. Meça desintegrações por minuto por cintilação líquida como descrito anteriormente. Após a normalização dos dados para um tempo de exposição de um segundo e uma altura da coluna amostral de 15 milímetros, a linha de calibração final foi calculada utilizando-se uma regressão de Poisson.

A correlação entre a densidade da área e a contagem de fótons tem um caráter linear. A inclinação da curva é de 81,04. Isso significa que uma taxa de contagem de fótons de 8.104 em uma amostra exposta por um segundo equivale a uma densidade de área de 100 nanogramas por centímetro quadrado de ficoerthrin.

O desvio padrão em amostras concentradas mais altas pode ser explicado por um processo de autoabsorção dentro da amostra. A curva de calibração clorofila A mostra características semelhantes e tem caráter linear com inclinação de 8,94. Seis amostras filtradas de gelo e neve foram medidas com o instrumento LIFE antes da extração da clorofila e as subsequentes medições de espectro de absorção para análise de teor de clorofila.

As amostras são encomendadas pelo seu teor de clorofila adquirido pela espectrometria de absorvância. Os dados life mostram pequenos desvios padrão que sugerem que o material no filtro foi distribuído relativamente igualmente. O instrumento LIFE subestima o teor de clorofila dos três primeiros filtros.

Os últimos três filtros, que mostram um menor teor de clorofila, são superestimados pelo instrumento LIFE. A razão da disparidade de dados pode ser explicada pela espessura do bolo de filtro. Em bolos de filtro finos, ilustrados em laranja, sinais de baixa fluorescência são capturados devido à baixa densidade de área dos pigmentos.

Os sinais de clorofila A são ilustrados em vermelho nesta imagem bruta. Todas as áreas cinzentas nesta imagem bruta indicam que o próprio filtro exibe sinais induzidos por laser após passar o filtro de passagem longa de 450 nanômetros. O software enganosamente contou este sinal como fluorescência clorofila A.

O alto teor de pigmento foi subestimado porque o laser não podia induzir a resposta à fluorescência em moléculas de clorofila A em camadas mais profundas do bolo de filtro. O experimento de exposição a laser não indica nenhum efeito significativo na produtividade primária e secundária dos tapetes bacterianos. Nem o tempo de exposição de cinco a 60 segundos nem a intensidade do laser variando de cinco a 50 miliwatts mostraram qualquer efeito nos resultados de produtividade.

Isso implica que as maiores intensidades e tempos de exposição necessários para produzir melhores sinais não prejudicariam as células. Quatro crioconitas foram medidas in-situ e são comparadas com a solução padrão de clorofila que foi medida em condições laboratoriais mostradas em vermelho. Os picos de fluorescência espectral em azul combinavam com o espectro padrão da clorofila, fornecendo assim o conceito de medições in-situ.

Medidas de vida foram realizadas em solos, tapetes bacterianos, biofilmes e crioconitas. Medidas de vida de crioconitas com uma espessa camada de sedimentos são possíveis se a área de superfície coberta de crioconita exceder 12,5 centímetros quadrados. Este tipo de crioconita bloqueia a luz desviada de debaixo do gelo.

Em finas camadas crioconitas, os sinais de fluorescência são envoltos pela luz ambiente. Assim, as medições life de superfícies de gelo nuas não são possíveis enquanto todos os outros tipos de amostra podem ser analisados pelo instrumento LIFE. Mudanças de temperatura levam a uma maior disponibilidade de água líquida, o que resulta em maior atividade biológica nas superfícies das geleiras.

Como consequência, a concentração de pigmento pode aumentar. É crucial monitorar essas mudanças e prever cenários possíveis e prováveis futuros.