Kriosferik Habitatlarda Biyobelirteçlerin Yerinde Ölçümleri için Yeni Non-Invaziv Araç Olarak Lazer Kaynaklı Floresan Emisyon (L.I.F.E.)

Bu çalışmanın genel amacı, kriosferik habitatlarda biyobelirteçlerin yerinde ölçümleri için kullanılabilecek yeni bir cihazı kalibre etmek ve test etmektir. Cihaz, LIFE olarak adlandırılan Lazer Kaynaklı Floresan Emisyon teknolojisine dayanmaktadır. Mevcut standart örnekleme yöntemleri, taş ocağı, yontma ve testere ile numunelerin parçalanması ve erime ile sıcaklık kayması nedeniyle numune üzerinde fiziksel etkilere yol açmaktadır.

Bu yöntemler genellikle yerinde koşulların tahrif in-situ yol açar. Bu nedenle mikrobiyal yaşamın yerinde tespiti ve karakterizasyonu için yeni bir metodoloji çok önemlidir. Yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip yeni, non-invaziv, tahribatsız bir yöntem geliştirdik.

Lazere bağlı floresan emisyon tekniğinin uygulanması, supraglacial ortamların fototropik organizmalar tarafından diğer şeylerin yanı sıra yaşadığı gerçeğine dayanmaktadır. Bu organizmalar sırasıyla mavi ve yeşil lazer tarafından heyecanlanan porfirin bazlı aksesuar pigmentleri klorofil A ve phycoerythrin floresan desenlerin tespiti ile izlenebilir. Taşınabilir çift dalga boyu kiti 4,5 kilogram ağırlığında ve harici bir bilgisayar ile birlikte bir tripod üzerinde kullanılır.

Mercek tüpü numuneye doğru yönlendirilir. Daha sonra, yeşil beş miliwatt lazer spektrometrenin optik eksenine doğru polarize ışık yönlendirir polarize ışın ayırıcı geçtikten sonra örnek vurur. Örnek, kırmızı ile resimli floresan bir ışık sergiler.

Kollamalı ışığın yarısı polarize ışın ayırıcısını geçer ve lazer sinyallerini kaldıran uzun geçişli bir filtreden odaklanır. Daha sonra, sinyal iki ayarlanabilir jilet oluşan bir diyafram yarık vurur. Bir prizma spektrometresi, sinyal bir sensörüzerinde yakalanmadan önce yarık diyafram ışık ortogonal ince bir çizgi ayırır.

İşlem mavi lazer ile tekrarlanır. Ham veriler otomatik olarak taşınabilir bir bilgisayara aktarılır ve bu bilgisayar da yazılım çalışması için kullanılır. Üç ana bölüme ayrılmıştır.

Pozlama ayarı el ile yapılır. Burada, pozlama süresi ve sinyal yoğunluğu arasındaki düzeltme doğrusaldır. Açıklama alanı, bir örneğin açıklaması için kullanılır.

Sağ bölümde, ham görüntüler ölçüm biter bitmez görüntülenir. Bu özellik, alanında anında veri değerlendirmesi için çok önemlidir. Kırmızı alanlar, pozlama süresini kısaltarak önlenebilecek aşırı pozlanmış pikselleri gösterir.

12-bit gri tonlama ham görüntüler, tek boyutlu diyafram yarık ve CCD önünde prizma nedeniyle bir spektral bileşen nedeniyle bir mekansal bileşeni göstermektedir. Optik kısıtlamalara yanıt olarak, ham görüntüler deforme olur. Bu nedenle, bozulma derecesini tanıyan bir kod uygulanarak kırpılması ve yok edilmesi gerekir.

Daha sonra, dalga boyu kalibrasyonu 532 nanometre lazer yardımı ile yapılır. Yeşil ışık frekans 1, 064 nanometre kızılötesi lazer iki katına tarafından üretilir. Her iki dalga boyu da CCD tarafından algılanabilir ve bu nedenle her pikselin spektral konumu dewarped görüntülerde hesaplanabilir.

Daha sonra, resim belirli bir dalga boyu aralığına kadar kırpılır. Seçili piksel satırındaki her pikselin gri değerleri sayılır ve özetlenir. Gri bir değer sıfırdan 255'e kadar değişebilir.

Bundan sonra, her piksel satırı bir sayı için hesaplar. Bu grafikte, her piksel satırındaki gri değer sayımları uzamsal koordinatlar aleyhine çizilir. Bu aynı anda örnek içinde klorofil ve phycoerythrin bir nicel mekansal ayrımcılık sağlar.

Ayrıca, bir örneğin spektral özellikleri seçili piksel çizgilerinden çizilebilir. Alan kurulumu hızlı ve kolaydır. Aleti bir tripoda takın.

Lens tüpünü cihaza takın. Arduino USB kablosunu ve kamera kablosunu takın. Harici bilgisayarı USB kablosu kullanarak cihaza bağlayın.

Tripod bacaklarını, mercek tüpünü numuneyi kapsaya kadar ayarlayın. Yazılımı çalıştırın, örneği açıklayın ve bir ölçüm çalışması başlatın. Pigment kalibrasyonu için, görüntülendiği gibi bir stok çözeltisinden seyreltme satır serisi hazırlayın.

Klorofil A stok çözeltisi aseton ile seyreltilmesi gerekir ve phycoerythrin seyreltme distile steril su ile gerçekleştirilir. Her seyreltme adımının 15 mililitresi daha sonra gerekli olacaktır. Alüminyum folyo altında sararak ışık pigmentleri koruyun.

Klorofili bir dondurucuda ve phycoerythrin'i daha fazla kullanıma kadar buzdolabında saklayın. Daha sonra, yüksekliği 1,5 santimetre bir fark ile gösterildiği gibi bir raf oluşturun. Bir poli-scintillation plastik şişe en yüksek konsantre seyreltme beş mililitre ekleyin.

Bu hacim şişedeki 15 milimetre yüksekliğindeki su sütununa eşittir ve floresan yoğunluğunu ölçer. Sonra, rafın orta konumuna şişe yerleştirin ve aynı çözelti başka bir beş mililitre ekleyin. Kolon yüksekliği 45 milimetre ye eşit olan başka bir beş mililitre ile işlemi tekrarlayın.

Klorofil ve phycoerythrin için tüm seyreltme adımları ile işlemi tekrarlayın. Raf ve kolon yüksekliği, sıvıların yüzeyi LIFE cihazının odak noktasında yer aldığı için ölçüm de önemli bir rol oynar. Bir buzuldan kar ve buz örnekleri toplayın.

Ayrıca, buzul ön alanından mikrobiyal mat örnekleri toplamak. Bu çalışmada, Midtre Lovenbreen, Svalbard yüksek arktik takımadalar Ny-Alesund araştırma tesisleri yakın bir buzul seçildi. Kar ve buz örneklerini eritin ve vakumla GF/F filtreleri altında filtreleyin.

Filtre uygulanmış ses düzeyine dikkat edin. Daha sonra, yeşil ve mavi lazer kullanarak üçaylık dört rasgele alanlarda LIFE cihazı ile filtreleri ölçün. Filtrelenen alan ve filtrelenmiş hacim ile alan yoğunluğunu çarparak genel pigment konsantrasyonu hesaplayın.

Pigment konsantrasyonu bir litrelik bir hacim için normalleştirin. Filtreleri 30 mililitre aseton içeren bir şişeye koyun ve bir gecede dört derece santigrat derecede karanlıkta saklayın. Daha sonra, bir şişe alın ve sürekli modda% 50 güç iki dakika boyunca sonication önce buz üzerine yerleştirin.

Filtreyi sıkın ve şişeden çıkarın. Filtreye artık gerek yok. Bir şırınga için Tygon tüp takın ve şişe klorofil ekstraksiyon aseton karışımı çıkarın.

Tygon tüplerini GF5 filtre tutucuile değiştirin. Çözeltiyi kuvars cuvette aktarın. Aseton için emici spektrometreyi kalibre ettikten sonra, spektrometreye cuvette içeren numuneyi yerleştirin ve 400 ile 750 nanometre arasındaki emici özellikleri ölçün.

Daha sonra, spektrometreden cuvette çıkarın ve numuneye iki molar hidroklorik asit 200 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, örnekteki pheofitin içeriğini ölçmek için emicilik ölçüsünü tekrarlayın. Lazer ölçümünün bakteri topluluklarının aktivitesi üzerindeki etkisi henüz ayrıntılı olarak açıklanmaz.

Bu nedenle, etkisi birincil ve ikincil üretim yoluyla araştırılmıştır. Bakteri üretimi için, bizim bakteriyel mat beş aliquots almak. Trityum etiketli lösin alımı için üç aliquot kullanılır ve kontrol olarak iki aliquot kullanılır.

Formaldehit ile kontrolleri çalıştırın. Tüm aliquots trityum etiketli lösin ekleyin. Bu yordamı tüm örneklerle tekrarlayın.

Burada, deneysel tasarımımız için gerekli numune miktarı gösterilmektedir. Daha sonra, deneysel kurulumda belirtildiği gibi yeşil ve mavi lazer ile bakteriyel paspas ortaya çıkarmak. Daha sonra, henüz formaldehit ile tedavi edilmemiş tüm örnekleri inaktive.

Bir cryovial içine örnek aktarın ve trikloroasetik asit veya TCA ekleyin. Şişeyi 10,000 g'da beş dakika lığına santrifüj edin. Scintillation sıvı ekleyin ve bir poli-scintillation vial içine cryovial koyun.

Numuneleri sıvı bir sintillasyon sayacı ile analiz edin ve alım oranlarını hesaplayın. Fotosentez için, daha önce olduğu gibi iki koyulaştırılan beş aliquothazırlayın. Radyoaktif izleyici NaH14 CO3'ü ekleyin ve dört saat kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, numuneleri alüminyum folyoya sararak reaksiyonu durdurun. Daha önce açıklandığı gibi sıvı sintillasyon ile dakika başına parçalanmaları ölçün. Bir saniyelik pozlama süresi ve 15 milimetrelik bir numune sütun yüksekliği için verileri normalleştirdikten sonra, son kalibrasyon hattı Bir Poisson regresyonu kullanılarak hesaplanmıştır.

Alan yoğunluğu ve foton sayıları arasındaki korelasyon doğrusal bir karaktere sahiptir. Eğrinin eğimi 81.04'tür. Bu da bir saniye liğine açığa çıkarılan bir numunede 8, 104'lük bir foton sayımı oranının, santimetre karesi phycoerythrin'in 100 nanogramlık bir alan yoğunluğuna eşit olduğu anlamına gelir.

Yüksek konsantre numunelerde standart sapma, numune içindeki kendi kendine emme işlemi yle açıklanabilir. Klorofil A kalibrasyon eğrisi benzer özellikleri gösterir ve 8.94 eğimi ile doğrusal bir karaktere sahiptir. Klorofil ekstraksiyonu ve klorofil içerik analizi için sonraki absorbans spektrum ölçümleri öncesinde altı filtrelenmiş buz ve kar numunesi LIFE cihazı ile ölçüldü.

Numuneler, emici spektrometre tarafından elde edilen klorofil içeriği ne göre sıralanır. LIFE verileri, filtredeki malzemenin nispeten eşit olarak dağıtıldığını gösteren küçük standart sapmalar gösterir. LIFE cihazı ilk üç filtrenin klorofil içeriğini hafife eder.

Daha düşük klorofil içeriği gösteren son üç filtre, LIFE cihazı tarafından fazla tahmin edilir. Veri eşitsizliğinin nedeni filtre kekkalınlığı ile açıklanabilir. Turuncu ile resimli ince filtre keklerinde, pigmentlerin düşük alan yoğunlukları nedeniyle düşük floresan sinyalleri yakalanır.

Klorofil A sinyalleri bu ham görüntüde kırmızı ile gösterilmiştir. Bu ham görüntüdeki tüm gri alanlar, filtrenin 450 nanometre uzun geçiş filtresini geçtikten sonra lazerle indüklenen sinyaller gösterdiğini gösterir. Yazılım yanıltıcı klorofil A floresan olarak bu sinyali sayılır.

Lazer filtre kek derin tabakalarda klorofil A moleküllerinde floresan yanıt neden olamazdı çünkü yüksek pigment içeriği hafife alındı. Lazer maruziyet deneyi bakteriyel paspasların primer ve sekonder üretkenliği üzerinde önemli bir etki yaratmaz. Ne beş ila 60 saniye arasında pozlama süresi ne de 5 ila 50 miliwatt arasında değişen lazer yoğunluğu verimlilik sonuçları üzerinde herhangi bir etki göstermedi.

Bu, daha iyi sinyaller üretmek için gereken daha yüksek yoğunlukve maruz kalma sürelerinin hücrelere zarar vermez anlamına gelir. Dört kriyokonit yerinde ölçüldü ve kırmızı ile gösterilen laboratuvar koşullarında ölçülen klorofil standart çözeltisi ile karşılaştırıldı. Mavi spektral floresan zirveleri klorofil standart spektrumu ile eşleşen, böylece yerinde ölçümler kavramı sağlayan.

YAŞAM ölçümleri topraklarda, bakteriyel paspaslarda, biyofilmlerde ve kriyokonitlerde yapılmıştır. Kalın bir tortu tabakasına sahip kriyokonitlerin LIFE ölçümleri, kriyokonit kaplı yüzey alanının 12,5 santimetre kareyi aşması durumunda mümkündür. Bu tip kriyokonit, buzun altından gelen ışığı engeller.

İnce kriyokonit tabakalarında floresan sinyalleri ortam ışığı ile örtülür. Buna göre, diğer tüm numune tipleri LIFE cihazı ile analiz edilebilirken, çıplak buz yüzeylerinin LIFE ölçümleri mümkün değildir. Sıcaklık değişiklikleri, buzul yüzeylerinde daha yüksek biyolojik aktiviteye yol açan sıvı suyun daha fazla kullanılabilirliğine yol açar.

Sonuç olarak, pigment konsantrasyonu artabilir. Bu değişiklikleri izlemek ve olası ve olası gelecek senaryoları tahmin etmek çok önemlidir.