Emissione di fluorescenza indotta dal laser (L.I.F.E.) come nuovo strumento non invasivo per le misurazioni in-situ dei biomarcatori in Habitat criosferici

L'obiettivo generale di questo studio è calibrare e testare un nuovo dispositivo che può essere utilizzato per misurazioni in situ di biomarcatori in habitat criosferici. Il dispositivo è basato sulla tecnologia di emissione di fluorescenza indotta dal laser, denominata LIFE. Gli attuali metodi standard di campionamento portano a impatti fisici sul campione dovuti all'estrazione, alla disintegrazione dei campioni mediante scheggiatura e segatura e allo spostamento della temperatura mediante fusione.

Questi metodi spesso portano alla falsificazione delle condizioni in situ. Pertanto, è fondamentale una nuova metodologia per il rilevamento e la caratterizzazione in situ della vita microbica. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo non invasivo, non distruttivo con un'alta risoluzione spaziale e temporale.

L'applicazione di una tecnica di emissione di fluorescenza indotta dal laser si basa sul fatto che gli ambienti sovraglaciali sono abitati, tra le altre cose, da organismi fototropici. Questi organismi possono essere rintracciati rilevando modelli fluorescenti dei pigmenti accessori a base di porfirina clorofilla A e ficoerrina che sono eccitati rispettivamente da un laser blu e verde. Il kit portatile a doppia lunghezza d'onda pesa 4,5 chilogrammi e viene utilizzato su un treppiede in combinazione con un computer esterno.

Il tubo dell'obiettivo è diretto verso il campione. Quindi, un laser verde da cinque milliwatt colpisce il campione dopo aver superato uno splitter a fascio polarizzante che reindirizza la luce polarizzata verso l'asse ottico dello spettrometro. L'esemplare presenta una luce fluorescente illustrata in rosso.

Metà della luce collimata passa lo splitter del fascio polarizzante ed è focalizzata attraverso un filtro passa-lungo che rimuove i segnali laser. Successivamente, il segnale colpisce una fessura di apertura che consiste di due lamette regolabili. Un prisma separa spettralmente una linea fine di luce ortogonale all'apertura della fessura prima che il segnale sia catturato su un sensore.

La procedura viene ripetuta con il laser blu. I dati grezzi vengono trasferiti automaticamente su un computer portatile che viene utilizzato anche per il funzionamento del software. È diviso in tre sezioni principali.

La regolazione dell'esposizione viene eseguita manualmente. Qui, la correzione tra il tempo di esposizione e l'intensità del segnale è lineare. Il campo commento viene utilizzato per la descrizione di un esempio.

Nella sezione destra, le immagini non elaborati vengono visualizzate non appena la misurazione è terminata. Questa funzione è fondamentale per una valutazione immediata dei dati sul campo. Le aree rosse indicano pixel sovraesposti che possono essere evitati riducendo il tempo di esposizione.

Le immagini grezze in scala di grigi a 12 bit mostrano una componente spaziale a causa della fessura di apertura unidimensionale e una componente spettrale dovuta al prisma di fronte al CCD. In risposta ai vincoli ottici, le immagini non elaborati vengono distorte. Pertanto, devono essere ritagliati e dewartati applicando un codice che riconosca il grado di distorsione.

Successivamente, la calibrazione della lunghezza d'onda viene eseguita con l'aiuto del laser a 532 nanometri. La luce verde è prodotta dal raddoppio della frequenza di 1.064 nanometri laser a infrarossi. Entrambe le lunghezze d'onda possono essere rilevate dal CCD e quindi la posizione spettrale di ogni pixel può essere calcolata in immagini dewarped.

Quindi, l'immagine viene ritagliata fino a un dato intervallo di lunghezza d'onda. I valori grigi di ogni pixel in una linea di pixel selezionata vengono conteggiati e sommati. Un valore grigio può variare da zero a 255.

Successivamente, ogni linea di pixel rappresenta un numero. In questo grafico, i conteggi dei valori grigi di ogni linea di pixel vengono tracciati in base alle coordinate spaziali. Ciò consente una discriminazione spaziale quantitativa della clorofilla e della ficoerina simultaneamente all'interno del campione.

Inoltre, le proprietà spettrali di un campione possono essere tracciate da linee di pixel selezionate. La configurazione del campo è semplice e veloce. Attaccare lo strumento su un treppiede.

Collegare il tubo dell'obiettivo al dispositivo. Collegare il cavo USB Arduino e il cavo della fotocamera. Collegare il computer esterno allo strumento utilizzando un cavo USB.

Regolare le gambe del treppiede in modo che il tubo dell'obiettivo copra il campione. Eseguire il software, descrivere l'esempio e avviare un'esecuzione di misurazione. Per la calibrazione del pigmento, preparare una serie di righe di diluizione da una soluzione stock come visualizzato.

La soluzione stock di clorofilla A deve essere diluita con acetone e la diluizione di ficoerina viene eseguita con acqua sterile distillata. Quindici millilitri di ogni fase di diluizione saranno necessari in seguito. Proteggere i pigmenti dalla luce avvolgendoli sotto un foglio di alluminio.

Conservare la clorofilla in un congelatore e la ficoerytrina in frigorifero fino a un ulteriore utilizzo. Successivamente, costruisci un rack come mostrato con un dislivello di 1,5 centimetri. Aggiungere cinque millilitri della diluizione concentrata più alta in una fiala di plastica poli-scintillazione.

Questo volume equivale a una colonna d'acqua alta 15 millimetri nel flaconcino e misura l'intensità della fluorescenza. Quindi, posizionare il flaconcino nella posizione centrale del rack e aggiungere altri cinque millilitri della stessa soluzione. Ripetere la procedura con altri cinque millilitri che equivale a 45 millimetri di altezza della colonna.

Ripetere la procedura con tutti i passaggi di diluizione per clorofilla e ficoerrina. L'altezza del rack e della colonna gioca un ruolo importante per la misurazione poiché la superficie dei liquidi si trova nel punto focale dello strumento LIFE. Raccogli campioni di neve e ghiaccio da un ghiacciaio.

Inoltre, raccogliere campioni di tappeti microbici dal campo di recupero del ghiacciaio. In questo studio è stato scelto Midtre Lovenbreen, un ghiacciaio vicino alle strutture di ricerca di Ny-Alesund nell'alto arcipelago artico delle Svalbard. Sciogliere campioni di neve e ghiaccio e filtrarli sotto i filtri GF/F.

Si noti il volume filtrato. Quindi, misurare i filtri con il dispositivo LIFE su quattro aree casuali ciascuna in triplicati utilizzando il laser verde e blu. Calcola la concentrazione complessiva del pigmento moltiplicando la densità dell'area con l'area filtrata e il volume filtrato.

Normalizzare la concentrazione del pigmento in un volume di un litro. Mettere i filtri in una fiala con 30 millilitri di acetone e conservarli al buio a quattro gradi centigradi durante la notte. Quindi, prendere una fiala e posizionarla sul ghiaccio prima della sonicazione per due minuti con una potenza del 50% in modalità continua.

Spremere e rimuovere il filtro dal flaconcino. Il filtro non è più necessario. Attaccare il tubo Tygon a una siringa e rimuovere la miscela di acetone di estrazione della clorofilla dal flaconcino.

Sostituire il tubo Tygon con un portafiltro GF5. Trasferire la soluzione in una cuvetta al quarzo. Dopo aver calibrato lo spettrometro di assorbanza per l'acetone, posizionare il campione contenente cuvetta nello spettrometro e misurare le caratteristiche di assorbanza tra 400 e 750 nanometri.

Quindi, rimuovere la cuvetta dallo spettrometro e aggiungere 200 microlitri di due acido cloridrico molare al campione. Quindi, ripetere la misurazione dell'assorbanza per misurare il contenuto di feofitina nel campione. L'effetto della misurazione laser sull'attività delle comunità batteriche non è ancora descritto in dettaglio.

Pertanto, l'effetto è stato studiato attraverso la produzione primaria e secondaria. Per la produzione batterica, prendi cinque aliquote del nostro tappetino batterico. Per l'assorbimento delle leucine con etichetta trizio vengono utilizzate tre aliquote e come controlli vengono utilizzate due aliquote.

Disattivare i controlli con formaldeide. Aggiungere leucina con etichetta trizio a tutte le aliquote. Ripetere tale procedura con tutti i campioni.

Qui, la quantità di campione richiesta viene mostrata per il nostro progetto sperimentale. Successivamente, esporre il tappetino batterico con il laser verde e blu come indicato nella configurazione sperimentale. Quindi, inattivare tutti i campioni che non sono ancora stati trattati con formaldeide.

Trasferire il campione in un criooviale e aggiungere acido tricloroacetico o TCA. Centrifugare la fiala a 10.000 g per cinque minuti. Aggiungere il liquido di scintillazione e mettere il criooviale in una fiala poli-scintillazione.

Analizzare i campioni con un contatore di scintillazione liquida e calcolare i tassi di assorbimento. Per la fotosintesi, preparare cinque aliquote come prima delle quali due sono oscurate. Aggiungere il tracciante radioattivo NaH14 CO3 e incubare per quattro ore.

Dopo l'incubazione, interrompere la reazione avvolgendo i campioni in un foglio di alluminio. Misurare le disintegrazioni al minuto mediante scintillazione liquida come descritto in precedenza. Dopo aver normalizzante i dati per un tempo di esposizione di un secondo e un'altezza della colonna campione di 15 millimetri, la linea di calibrazione finale è stata calcolata utilizzando una regressione di Poisson.

La correlazione tra densità dell'area e conteggi dei fotoni ha un carattere lineare. La pendenza della curva è 81.04. Ciò significa che un tasso di conteggio dei fotoni di 8.104 in un campione esposto per un secondo equivale a una densità di area di 100 nanogrammi per centimetro al quadrato di ficoerytrina.

La deviazione standard nei campioni concentrati più alti può essere spiegata da un processo di auto-assorbimento all'interno del campione. La curva di calibrazione della clorofilla A mostra caratteristiche simili e ha un carattere lineare con una pendenza di 8,94. Sei campioni filtrati di ghiaccio e neve sono stati misurati con lo strumento LIFE prima dell'estrazione della clorofilla e delle successive misurazioni dello spettro di assorbimento per l'analisi del contenuto di clorofilla.

I campioni sono ordinati in base al loro contenuto di clorofilla acquisito dalla spettrometria di assorbanza. I dati LIFE mostrano piccole deviazioni standard che suggeriscono che il materiale sul filtro è stato distribuito in modo relativamente equo. Lo strumento LIFE sottovaluta il contenuto di clorofilla dei primi tre filtri.

Gli ultimi tre filtri, che presentano un contenuto inferiore di clorofilla, sono sopravvalutati dallo strumento LIFE. Il motivo della disparità dei dati può essere spiegato dallo spessore della torta filtrante. Nelle torte filtranti sottili, illustrate in arancione, vengono catturati segnali a bassa fluorescenza a causa della bassa densità di area dei pigmenti.

I segnali di clorofilla A sono illustrati in rosso in questa immagine grezza. Tutte le aree grigie di questa immagine grezza indicano che il filtro stesso mostra segnali indotti dal laser dopo aver superato il filtro passa-lungo di 450 nanometri. Il software contava fuorviantmente questo segnale come clorofilla A fluorescenza.

L'alto contenuto di pigmenti è stato sottovalutato perché il laser non poteva indurre una risposta di fluorescenza nelle molecole di clorofilla A in strati più profondi della torta filtrante. L'esperimento di esposizione laser non indica alcun effetto significativo sulla produttività primaria e secondaria dei tappetini batterici. Né il tempo di esposizione da cinque a 60 secondi né l'intensità del laser che variava da cinque a 50 milliwatt mostravano alcun effetto sui risultati della produttività.

Ciò implica che le maggiori intensità e tempi di esposizione necessari per produrre segnali migliori non danneggerebbe le cellule. Quattro crioconiti sono state misurate in situ e vengono confrontate con la soluzione standard di clorofilla che è stata misurata in condizioni di laboratorio mostrate in rosso. I picchi di fluorescenza spettrale in blu corrispondevano allo spettro standard della clorofilla, fornendo così il concetto di misurazioni in situ.

Le misurazioni LIFE sono state eseguite su suoli, tappetini batterici, biofilm e crioconiti. Le misurazioni LIFE delle crioconiti con uno spesso strato di sedimento sono possibili se la superficie coperta di crioconite supera i 12,5 centimetri quadrati. Questo tipo di crioconite blocca la luce vagante da sotto il ghiaccio.

Nei sottili strati di crioconite, i segnali di fluorescenza sono avvolti dalla luce ambientale. Di conseguenza, le misurazioni LIFE delle superfici di ghiaccio nudo non sono possibili mentre tutti gli altri tipi di campioni possono essere analizzati dallo strumento LIFE. Le variazioni di temperatura portano ad una maggiore disponibilità di acqua liquida che si traduce in una maggiore attività biologica sulle superfici del ghiacciaio.

Di conseguenza, la concentrazione di pigmento può aumentare. È fondamentale monitorare questi cambiamenti e prevedere possibili e probabili scenari futuri.