この研究の全体的な目標は、凍結圏の生息地におけるバイオマーカーのその際の測定に使用できる新しいデバイスを較正し、テストすることです。この装置は、レーザー誘導蛍光発光技術に基づいており、LIFEと呼ばれます。現在の標準的なサンプリング方法は、採石、チッピングとソーイングによるサンプルの崩壊、融解による温度変化による試料への物理的な影響につながります。
これらの方法は、多くの場合、その中での状態の改ざんにつながります。そのため、微生物の生命のイン・ザ・イン・ザ・スポット検出と特性評価のための新しい方法論が重要です。我々は、高い空間的および時間的分解能を有する新しい非侵襲的、非破壊的な方法を開発した。
レーザー誘導蛍光発光技術の適用は、とりわけ光熱帯生物によって、上層氷河環境が生息しているという事実に基づいている。これらの生物は、それぞれ青色および緑色のレーザーによって励起されるポルフィリンベースのアクセサリー顔料クロロフィルAおよびフィコエリスリンの蛍光パターンの検出によって追跡することができる。ポータブルデュアル波長キットは4.5キログラムの重量を量り、外付けコンピュータと組み合わせて三脚で使用されます。
レンズチューブは標本に向けられる。次に、分光計の光軸に向かって偏光をリダイレクトする偏光ビームスプリッターを通過した後、緑色の5ミリワットレーザーがサンプルに当たる。検体は赤色で示した蛍光灯を呈する。
コリメートされた光の半分は偏光ビームスプリッターを通過し、レーザー信号を除去するロングパスフィルターを通して焦点を合わせる。次に、信号は2つの調整可能なカミソリの刃から成っている絞りスリットに当たります。プリズムは、信号がセンサーにキャプチャされる前に、スリット開口部に直交する光の細かい線を分離します。
手順は、青色のレーザーで繰り返されます。生データは、ソフトウェア操作にも使用されるポータブルコンピュータに自動的に転送されます。それは3つの主要なセクションに分かれています。
露出調整は手動で行われます。ここで、露光時間と信号強度の補正は直線的である。コメント フィールドは、サンプルの説明に使用されます。
右側のセクションでは、測定が終了するとすぐに生画像が表示されます。この機能は、現場での即時データ評価に不可欠です。赤い領域は露出過多のピクセルを示し、露光時間を短縮することで回避できます。
12ビットのグレースケールの生画像は、CCDの前にプリズムが原因の1次元開口スリットとスペクトル成分による空間成分を示しています。光学的な制約に応じて、生の画像は歪みます。したがって、歪みの程度を認識するコードを適用して、トリミングおよびデワープする必要があります。
次に、波長較正は532ナノメートルレーザーの助けを借りて行われます。緑色の光は1,064ナノメートルの赤外線レーザーの周波数倍加によって生成される。両方の波長はCCDによって検出することができるので、各ピクセルのスペクトル位置はデワード画像で計算することができる。
次に、画像は所定の波長範囲に切り取られます。選択したピクセルラインの各ピクセルのグレー値は、カウントされ、合計されます。グレーの値は、0 から 255 の範囲で指定できます。
その後、すべてのピクセルラインが1つの数字を占めます。このグラフでは、各ピクセル線のグレー値の数が空間座標に対してプロットされます。これにより、クロロフィルとフィコエリスリンの定量的な空間的な識別が同時にサンプル内で可能になります。
さらに、選択したピクセル線からサンプルのスペクトルプロパティをプロットすることもできます。フィールドの設定は迅速かつ簡単です。三脚に器具を取り付けます。
レンズチューブをデバイスに取り付けます。Arduino USBケーブルとカメラケーブルを接続します。USBケーブルを使用して、外部コンピュータを機器に接続します。
レンズチューブが標本を覆う方法で三脚脚を調整します。ソフトウェアを実行し、サンプルを説明し、測定実行を開始します。顔料キャリブレーションの場合は、表示された状態でストック溶液から希釈行シリーズを用意します。
クロロフィルAストック溶液はアセトンで希釈する必要があり、フィコエリスリン希釈は蒸留滅菌水で行われる。各希釈ステップの15ミリリットルは後で必要になります。アルミニウム箔で包んで光から顔料を保護します。
クロロフィルは冷凍庫に、フィコエリスリンは冷蔵庫に保管し、さらに使用します。次に、高さが 1.5 センチメートルの差を持つラックを構築します。ポリシンチレーションプラスチックバイアルに最高の濃縮希釈液の5ミリリットルを追加します。
この体積はバイアル内の15ミリメートルの高い水柱に相当し、蛍光強度を測定する。次に、バイアルをラックの中央の位置に置き、同じ溶液のさらに5ミリリットルを加えます。列の高さ 45 ミリメートルに等しい別の 5 ミリリットルで手順を繰り返します。
クロロフィルとフィコエリトリンのすべての希釈ステップで手順を繰り返します。液体の表面はLIFE機器の焦点にあるので、ラックとカラムの高さは測定に重要な役割を果たします。氷河から雪や氷のサンプルを収集します。
さらに、氷河の前野から微生物マットのサンプルを集める。本研究では、スバールバル諸島の高北極諸島にあるナイ・アレスウンドの研究施設に近い氷河、ミッドレ・ラヴェレンブリーンが選ばれました。雪や氷のサンプルを溶かし、GF/Fフィルターの下で真空フィルター。
フィルタリングされたボリュームをメモします。次に、緑と青のレーザーを使用して、4つのランダムな領域でLIFEデバイスでフィルタを測定します。濾過面積とフィルターされた体積で面積密度を乗じて、全体的な顔料濃度を計算します。
顔料濃度を1リットルの体積に正規化します。フィルターを30ミリリットルのアセトンをバイアルに入れ、一晩4度の暗闇の中に保管します。次に、バイアルを取り、連続モードで50%の電源で2分間超音波処理する前に氷の上に置きます。
バイアルからフィルターを絞り、取り外します。フィルタは不要になりました。タイゴンチューブをシリンジに取り付け、バイアルからクロロフィル抽出アセトンミックスを取り除きます。
タイゴンチューブをGF5フィルターホルダーに交換してください。水晶キュベットに溶液を移します。アセトンの吸光度分光計を校正した後、キュベットを含むサンプルを分光計に入れ、400~750ナノメートルの吸光度を測定します。
次に、分光計からキュベットを取り出し、2モル塩酸200マイクロリットルをサンプルに加えます。次いで、試料中のフェオフィチン含有量を測定するために吸光度測定を繰り返す。細菌群集の活動に対するレーザー測定の効果は、まだ詳しく説明されていない。
したがって、その効果は一次生産と二次生産を介して調査された。細菌の生産のために、私たちの細菌マットの5つのアリコートを取ります。トリチウム標識ロイシン取り込みには3つのアリコートが使用され、2つのアリコートがコントロールとして使用されます。
ホルムアルデヒドでコントロールを無効にします。トリチウム標識ロイシンをすべてのアリコートに加えます。すべてのサンプルでこの手順を繰り返します。
ここでは、実験計画に必要なサンプル量を示します。次に、実験用セットアップで示されているように、緑色と青のレーザーで細菌マットを露出する。次いで、ホルムアルデヒドで処理されていないすべてのサンプルを不活性化する。
サンプルをクリボビアルに移し、トリクロロ酢酸またはTCAを加えます。バイアルを10,000gで5分間遠心分離する。シンチレーション液を加え、クリボビアルをポリシンチレーションバイアルに入れます。
液体シンチレーションカウンターでサンプルを分析し、取り込み率を計算します。光合成のために、2つを暗くする前と同様に5つのアリコートを準備する。放射性トレーサーNaH14 CO3を加え、4時間インキュベートします。
インキュベーション後、試料をアルミ箔で包み、反応を停止する。前に述べたように液体シンチレーションによって毎分崩壊を測定する。1秒の露光時間と15ミリメートルのサンプルカラムの高さのデータを正規化した後、最終的なキャリブレーションラインはポアソン回帰を使用して計算されました。
面積密度とフォトン数の相関は、線形文字を持ちます。曲線の傾きは 81.04 です。つまり、1秒間に露出した試料中の光子数率8,104は、フィコエリトリンの100ナノグラム平方センチメートルの面積密度に等しい。
高濃度サンプルの標準偏差は、サンプル内の自己吸収プロセスによって説明することができます。クロロフィルAの校正曲線は、同様の特性を示し、8.94の傾きを持つ線形文字を有する。クロロフィル抽出前にLIFE機器で6つの濾過された氷と雪のサンプルを測定し、その後のクロロフィル含有量分析用の吸光度スペクトル測定を行った。
サンプルは、吸光度分析法によって取得されたクロロフィル含有量によってオーダーされます。LIFE データは、フィルター上の材料が比較的均等に分布していることを示唆する小さな標準偏差を示します。LIFE装置は最初の3つのフィルターのクロロフィルの含有量を過小評価する。
クロロフィル含有量が低い最後の3つのフィルタは、LIFE機器によって過大評価されています。データの不一致の理由は、フィルターケーキの厚さによって説明することができます。薄いフィルターケーキでは、オレンジ色で示される、低蛍光信号は、顔料の低面積密度のために捕捉される。
クロロフィルA信号は、この生画像では赤で示されています。この生画像のすべての灰色の領域は、フィルタ自体が450ナノメートルのロングパスフィルタを通過した後にレーザー誘導信号を示すことを示しています。ソフトウェアは誤解を招くほどこのシグナルをクロロフィルA蛍光として数えた。
高い顔料内容物は、レーザーがフィルターケーキのより深い層のクロロフィルA分子で蛍光応答を誘導することができなかったため過小評価された。レーザー露光実験は、細菌マットの一次および二次生産性に有意な影響を与えがないことを示す。5~60秒の露光時間も、5~50ミリワットのレーザー強度も生産性の結果に影響を及ぼさなかった。
これは、より良い信号を生成するために必要な高強度と露光時間が細胞に害を与えないことを意味します。4つのクライオコサイトをその場で測定し、赤で示された実験室条件下で測定されたクロロフィル標準溶液と比較される。青色のスペクトル蛍光ピークはクロロフィル標準スペクトルと一致し、その際の測定の概念を提供します。
LIFEの測定は、土壌、細菌マット、バイオフィルム、およびクライオコナイト上で行われています。凍結堆積物層を有する凍結堆積物の寿命測定は、凍結基面が12.5センチメートルの2乗を超える場合に可能である。このタイプの凍結基は氷の下から迷い光をブロックします。
薄いクライオコライト層では、蛍光信号は周囲光によって包まれています。したがって、裸の氷の表面のLIFE測定は不可能ですが、他のすべてのサンプルタイプはLIFE機器によって分析することができます。温度変化は、氷河表面上のより高い生物学的活性をもたらす液体水の利用可能性を高める。
その結果、顔料濃度が上昇する可能性があります。これらの変更を監視し、今後のシナリオの可能性を予測することが重要です。
